急性胰腺炎患者血清miR-25-3p、TLR4水平變化及其臨床意義

熊燕 周穎 蔣桂珍

[摘要]?目的?檢測血清微RNA（microRNA，miR）-25-3p，Toll樣受體4（Toll-like?receptor?4，TLR4）的表達水平，并討論兩者與急性胰腺炎（acute?pancreatitis，AP）患者預后的關系。方法?選取2019年3月至2021年3月麗水市第二人民醫院收治的178例AP患者作為AP組，同期體檢的健康者100例作為對照組。AP組根據病情分為輕型急性胰腺炎（mild?acute?pancreatitis，MAP）組（n=95）和重癥急性胰腺炎（severe?acute?pancreatitis，SAP）組（n=83），根據治療后3個月預后情況分為生存組（n=148）和死亡組（n=30）。比較miR-25-3p、TLR4在各組患者血清中的表達水平，分析miR-25-3p與TLR4表達水平的相關性，采用多因素Logistic回歸分析AP患者預后的影響因素，受試者操作特征（receiver?operator?characteristic，ROC）曲線分析血清miR-25-3p、TLR4預測AP患者預后的價值。結果?AP組血清miR-25-3p表達水平明顯低于對照組，TLR4表達水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。SAP組血清miR-25-3p表達水平明顯低于MAP組，TLR4表達水平明顯高于MAP組，差異均有統計學意義（P<0.05）。AP組miR-25-3p表達水平與TLR4呈負相關（r=-0.731，P<0.001）。生存組的血清miR-25-3p表達水平明顯高于死亡組，而TLR4表達水平明顯低于死亡組，差異均有統計學意義（P<0.05）。Logistic回歸分析顯示，脂肪酶、急性生理與慢性健康評分Ⅱ（acute?physiological?and?chronic?health?evaluation-Ⅱ，APACHE?Ⅱ）評分及miR-25-3p為AP患者預后的影響因素。ROC結果顯示，血清miR-25-3p、TLR4及聯合預測AP預后死亡的曲線下面積為0.844[95%置信區間（confidence?interval，CI）：0.784～0.904、0.835（95%CI：0.734～0.936）及0.914（95%CI：0.861～0.967）。結論?AP患者血清miR-25-3p表達水平降低，TLR4表達水平升高，二者均與病情嚴重程度及預后有關，聯合檢測其表達水平有助于評估預后。

[關鍵詞]?急性胰腺炎；微RNA-25-3p；Toll樣受體4；病情嚴重程度；預后

[中圖分類號]?R576??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.08.005

Changes?of?serum?miR-25-3p?and?TLR4?levels?in?patients?with?acute?pancreatitis?and?their?clinical?significance

XIONG?Yan1，?ZHOU?Ying2，?JIANG?Guizhen1

1.Department?of?Laboratory，?Lishui?Second?People's?Hospital，?Lishui?323000，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Laboratory，?Lishui?people's?Hospital，?Lishui?323000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?detect?the?expression?levels?of?serum?micro-RNA-25-3p?（miR-25-3p）?and?Toll-like?receptor?4?（TLR4），?and?to?discuss?the?relationship?between?the?two?and?the?prognosis?of?patients?with?acute?pancreatitis?（AP）.?Methods?A?total?of?178?patients?with?AP?admitted?to?Lishui?Second?People's?Hospital?from?March?2019?to?March?2021?were?selected?as?the?AP?group，?and?100?healthy?individuals?who?were?examined?during?the?same?period?were?used?as?the?control?group.?the?AP?group?was?divided?into?mild?acute?pancreatitis?（MAP）?group?（n=95）?and?severe?acute?pancreatitis?（SAP）?group?（n=83）?according?to?their?conditions.?and?the?survival?group?（n=148）?and?death?group?（n=30）?according?to?the?prognosis?at?3?months?after?treatment.?The?expression?levels?of?miR-25-3p?and?TLR4?in?the?serum?of?patients?in?each?group?were?compared，?the?correlation?between?miR-25-3p?and?TLR4?expression?levels?was?analyzed，?and?the?factors?influencing?the?prognosis?of?AP?patients?were?analyzed?using?multi-factor?Logistic?regression，?and?the?value?of?serum?miR-25-3p?and?TLR4?in?predicting?the?prognosis?of?AP?patients?was?analysed?using?receiver?operator?characteristic?（ROC）?curves.?Results?The?expression?level?of?serum?miR-25-3p?in?AP?group?was?significantly?lower?than?that?in?normal?control?group，?and?the?expression?level?of?TLR4?was?significantly?higher?than?that?in?normal?control?group?（P<0.05）.?The?expression?level?of?serum?miR-25-3p?in?the?SAP?group?was?significantly?lower?than?that?in?the?MAP?group，?and?the?expression?level?of?TLR4?was?significantly?higher?than?that?in?the?MAP?group?（P<0.05）.?miR-25-3p?was?negatively?correlated?with?TLR4?in?AP?group?patients?（r=-0.731，?P<0.001）.?The?expression?level?of?miR-25-3p?in?the?survival?group?was?significantly?higher?than?that?in?the?death?group，?while?the?level?of?TLR4?was?significantly?lower?than?that?in?the?death?group?（P<0.05）.?Regression?analysis?showed?that?lipase，?acute?physio-logical?and?chronic?health?evaluation-Ⅱ?（APACHEⅡ）?score?and?miR-25-3p?were?the?prognostic?factors?of?AP?patients.?The?ROC?results?showed?that?the?areas?under?the?curve?of?serum?miR-25-3p，?TLR4?and?their?combination?predicting?the?prognosis?of?AP?death?were?0.844?[95%?confidence?interval?（CI）：?0.784-0.904]，?0.835?（95%CI：?0.734-0.936）?and?0.914?（95%CI：?0.861-0.967）.?Conclusion?The?expression?level?of?serum?miR-25-3p?in?patients?with?acute?pancreatitis?is?decreased，?and?the?expression?level?of?TLR4?is?increased，?both?of?which?were?related?to?the?severity?of?the?disease?and?prognosis.?The?combined?detection?of?their?expression?levels?is?helpful?to?evaluate?the?prognosis.

[Key?words]?Acute?pancreatitis;?microRNA-25-3p;?Toll-like?receptor?4;?Severity?of?illness;?Prognosis

急性胰腺炎（acute?pancreatitis，AP）是消化道最常見的由多種原因引起的胰腺炎癥性疾病，發病率較高，是胰腺內胰酶由于各種因素被激活后而引發胰腺腺泡細胞損傷、間質水腫、出血的炎性反應[1]。AP的病情復雜多變，病變程度輕重不一，輕型急性胰腺炎（mild?acute?pancreatitis，MAP）易于治愈，而重癥急性胰腺炎（severe?acute?pancreatitis，SAP）則危及生命，病死率可達30%[2]。近20年來隨著國內外學者的不斷探索，AP已經形成了被廣泛認可的臨床治療體系。然而，多年來AP患者的預后并沒有顯著變化。因此，了解AP的發病機制、及早確診以防止病情遷延加重，是改善這一疾病預后不良的關鍵。微RNA（microRNAs，miRs）是一類進化上高度保守的單鏈核苷酸序列，通過結合靶向mRNAs的3'非翻譯區，在許多生理和病理過程中發揮重要的調節作用。研究表明，miRNAs的表達水平在疾病檢測和嚴重程度診斷方面有很好的評估價值，且miRNAs被證實在胰腺炎中的表達與正常胰腺有顯著差異，如miR-373-5p，miR-374a-5p在胰腺炎中的表達顯著下調[3]。miR-25-3p作為miRNAs家族成員之一，通過調控靶標mRNA與炎癥反應的進展有關[4]。Toll樣受體（Toll-like?receptor，TLR）是Ⅰ型跨膜蛋白，是一類天然免疫受體，在對腸道微生物的免疫耐受中起著關鍵作用[5]。TLR4是TLR家族中最先發現的成員，位于全身許多不同類型的細胞，已被證明參與多種慢性或急性炎癥疾病的發展[6]。miR-25-3p和TLR4均被證實與炎癥疾病密切相關，因此，本研究旨在探究血清miR-25-3p和TLR4水平與AP病情及預后的關系。

1??資料與方法

1.1??一般資料

選取2019年3月至2021年3月麗水市第二人民醫院收治的178例AP患者作為AP組，同期體檢的健康者100例作為對照組。AP組中，男104例，女74例，平均年齡（49.59±6.39）歲。對照組中，男55例，女45例，平均年齡（50.13±5.05）歲。依據AP分級標準[7]將178例AP患者分為輕型急性胰腺炎（mild?acute?pancreatitis，MAP）組（n=95）和重癥急性胰腺炎（severe?acute?pancreatitis，SAP）組（n=83）；根據AP患者治療后3個月預后情況，將其分為生存組（n=148）和死亡組（n=30）。AP患者納入標準：①符合《中國急性胰腺炎診治指南》[8]中的診斷標準；②起病急，發病48h內入院；③無胰腺炎疾病史。對照組納入標準：①無慢性或基礎疾病史；②無任何臨床癥狀；③體檢結果正常。排除標準：①合并其他急性或慢性炎癥；②全身免疫性疾病或凝血功能障礙；③合并呼吸衰竭、腎衰竭等基礎疾病；④嚴重精神疾病；⑤臨床信息不全；⑥合并胃潰瘍、膽道手術、胃腸腫瘤等消化道疾病。本研究經所有受試者均知情并簽署知情同意書，經麗水市第二人民醫院醫學倫理委員會審批通過（倫理審批號：K2018274）。

1.2??方法

1.2.1??數據收集??收集AP患者年齡、性別、體質量指數（body?mass?index，BMI）、吸煙史、飲酒史、AP病因及脂肪酶、血鈣、白細胞計數（white?blood?cell?count，WBC）、C反應蛋白（C?reactive?protein，CRP）、空腹血糖（fasting?blood?sugar，FBG）、急性生理與慢性健康評分Ⅱ（acute?physiological?and?chronic?health?evaluation-Ⅱ，APACHE?Ⅱ）。所有AP患者和對照組均在清晨空腹狀態下抽取靜脈血5ml，靜置25min后離心取血清，裝于無RNA酶的EP管中，-80℃保存備用。使用前，將血清于冰上解凍。

1.2.2??血清miR-25-3p相對表達量檢測??取0.25ml血清參照Trizol試劑盒（貨號：CD-13433-ML，購自武漢純度生物科技有限公司）的方法提取血清總RNA，并檢測RNA的完整度和濃度，合格的RNA采用iScript?cDNA反轉錄試劑盒[貨號：1708890，購自Bio-Rad生命醫學產品（上海）有限公司]轉錄得到cDNA，置于-20℃保存，以cDNA為模板，采用qRT-PCR法檢測血清miR-25-3p的表達水平，qRT-PCR反應使用SYBR?Green?Master?Mix試劑盒（貨號：Code?NO.?RR420L，購自日本Takara公司）和實時熒光定量PCR儀（型號：ABI7500，購自美國ABI公司）完成。qRT-PCR引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，以U6為內參基因。引物序列（5'-3'）為：miR-25-3p-F：ATTGCACTTGTC?TCGCTCTG，miR-25-3p-R：CCAAGCTTTCTCAGAC?CGAGACAAGTGC；U6-F：ATTGGAACGATACAG?AGAAGATT，U6-R：CGAACGCTTCACGAATTTG。反應體系共20?l：定量預混液10?l，cDNA（<100ng）2?l，上下游引物（10?mol/L）各0.4?l，ROX?Reference?Dye?（50×）0.08?l，ddH2O加至20?l。反應條件：95℃預變性30s，95℃?5s，60℃?30s，40個循環，每個樣品設置3個復孔，試驗共重復3次。采用2-??Ct法計算相對表達量。

1.2.3??血清TLR4水平檢測??采用酶聯免疫吸附法檢測血清TLR4水平，試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司（貨號：KL-TLR4-Hu），檢測嚴格按照試劑盒上的要求操作。

1.3??統計學方法

采用SPSS?25.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用例數（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Pearson分析AP患者血清miR-25-3p和TLR4的相關性。采用多因素Logistic回歸分析AP患者預后的影響因素，受試者操作特征（receiver?operator?characteristic，ROC）曲線分析血清miR-25-3p和TLR4水平預測AP患者預后的效能，P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??對照組和AP組血清miR-25-3p、TLR4表達水平比較

AP組血清miR-25-3p表達水平明顯低于對照組，TLR4表達水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2??MAP組和SAP組血清miR-25-3p、TLR4表達水平比較

SAP組血清miR-25-3p表達水平顯著低于MAP組，血清TLR4表達水平顯著高于MAP組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3??AP組血清miR-25-3p、TLR4表達水平相關性分析

相關性分析顯示，AP患者血清miR-25-3p與TLR4呈負相關（r=-0.731，P<0.001），見圖1。

2.4??生存組與死亡組一般資料比較

兩組間年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、病因、WBC、CRP及FBG水平相比，差異均無統計學意義（P>0.05）。死亡組與生存組的血鈣、脂肪酶水平及APACHE?Ⅱ評分比較，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.5??生存組與死亡組血清miR-25-3p、TLR4表達水平比較

生存組miR-25-3p表達水平高于死亡組，TLR4表達水平低于死亡組，差異均有統計學意義（P

2.6??影響AP患者預后的多因素Logistic回歸分析

以死亡為因變量，以單因素分析中差異有統計學意義的血鈣、脂肪酶、miR-25-3p、APACHE?Ⅱ評分為自變量，將其納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示脂肪酶、APACHE?Ⅱ評分為影響AP患者預后的危險因素，而miR-25-3p為影響預后的保護因素，見表5。

2.7??血清miR-25-3p、TLR4水平預測AP患者預后的ROC曲線分析

結果顯示，血清miR-25-3p預測AP預后死

亡的曲線下面積（area?under?the?curve，AUC）為0.844[95%置信區間（confidence?interval，CI）：0.784～0.904]，敏感度為80.00%，特異性為82.40%，截斷值為0.51；血清TLR4預測AP患者預后死亡的AUC為0.835（95%CI：0.734～0.936），敏感度為76.70%，特異性為84.50%，截斷值為28.55ng/ml。二者聯合預測的AUC為0.914（95%CI：0.861～0.967），敏感度為93.30%，特異性為81.80%，見圖2。

3??討論

AP是最常見的炎癥性疾病，任何年齡段均可發病。AP的臨床治療主要取決于疾病的嚴重程度，其中，MAP患者只需要短期住院治療，但SAP患者往往需要重癥監護，因此在疾病進展的早期準確診斷疾病嚴重程度，以便采取合適的臨床治療措施，對于改善AP患者預后情況至關重要。但迄今為止，還沒有單一的指標足以準診斷AP嚴重程度，有必要開發新的生物標志物，能夠可靠地診斷AP患者的嚴重程度。

miR-25-3p位于13號染色體7q22，據報道其對凋亡、自噬、氧化應激、炎癥、鈣處理等具有重要調控作用，是常見癌性和非癌性疾病的關鍵調節劑[7]。有研究發現，miR-25-3p在乳腺癌、食道癌等多種不同類型癌癥中表達上調，可促進細胞遷移和侵襲[9-10]。另外有研究表明，miR-25-3p在多種疾病中表達下調。最近的文獻證實，miR-25-3p在膿毒癥中表達降低，其低表達與敗血癥的嚴重程度有關，通過抑制炎癥反應可以減少由敗血癥引發的損傷[11]。Cisilotto等[12]研究顯示，急性肝硬化中miR-25-3p表達降低，可能是由全身炎癥引起的，其表達降低受肝臟疾病嚴重程度影響。Liu等[13]研究認為，血清miR-25-3p的表達水平在糖尿病腎病中通常被下調，影響該疾病的嚴重程度。本研究結果顯示，AP組血清miR-25-3p表達水平明顯低于對照組，說明miR-25-3p與AP疾病發生發展有關。SAP組的患者血清miR-25-3p表達水平顯著低于MAP組，結合以往的研究報道，提示miR-25-3p在AP發病過程中發揮作用，其下調表達與AP的嚴重程度密切相關。進一步分析miR-25-3p與預后的關系，本研究結果顯示，生存組患者miR-25-3p表達水平明顯高于死亡組，說明miR-25-3p異常表達參與AP疾病進展。多因素回歸分析顯示，miR-25-3p是AP患者預后的影響因素，提示miR-25-3p與AP預后密切相關，血清中miR-25-3p表達水平變化可以預測患者預后情況。ROC曲線結果顯示，miR-25-3p預測AP預后死亡的AUC為0.844，說明miR-25-3p對于AP疾病預后有一定的預測價值。

越來越多的證據表明miR-25-3p可能與控制炎癥反應相關基因表達有關[14]。TLR4是廣泛分布于多種細胞內的天然免疫重要炎癥分子，通過激活下游的信號通路，誘發炎癥反應因子，從而引起炎癥反應，且是miR-25-3p的潛在靶點。TLR4的表達與AP的發生、發展及病情的嚴重程度密切相關，敲除TLR4的小鼠比野生小鼠中的胰腺損傷和炎癥反應較輕，且AP的發展與TLR4及其下游的核因子-κB及p-STAT-3信號通路有關，提示TLR4可能通過抑制核因子-κB和p-STAT-3通路緩解SAP的發生與發展[15]。王彬等[16]在SAP組大鼠的研究中發現TLR4在腎臟組織的表達變化與血清促炎細胞因子的變化相一致，表明TLR4在在SAP中發揮促炎作用[17]。本研究結果顯示，與對照組相比，AP組的TLR4表達水平顯著升高，同時SAP組血清TLR4表達水平顯著高于MAP組，進一步證實TLR4參與AP的發生、發展，其表達水平可反映AP的嚴重程度。本研究結果顯示，死亡組TLR4表達水平高于生存組，說明TLR4異常表達參與AP疾病進展，ROC曲線結果提示TLR4的表達水平對于AP預后具有一定的預測價值。有研究表明，miR-25-3p與TLR4靶向結合抑制TLR4以及炎癥因子TNF-α、白細胞介素6、白細胞介素β的轉錄，從而抑制糖尿病腎病的發生發展[18]，本研究結果與其類似，在AP患者中，兩者表達水平呈負相關，初步證明miR-25-3p是TLR4重要的調節因子，但具體作用仍需進一步研究。為了提高對AP預后的預測價值，將其miR-25-3p與TLR4聯合預測AP預后，結果顯示，AUC為0.914（95%CI：0.861～0.967），敏感度為93.30%，特異性為81.80%，預測效能高于單一指標檢測，且能夠降低漏診率，提高準確率，從而有利于臨床盡早制定治療方案，改善預后。

綜上所述，急性胰腺炎患者血清miR-25-3p表達水平降低，TLR4表達水平升高，二者均與病情嚴重程度及預后有關，聯合檢測其表達水平有助于評估預后。

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