小麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因家族的鑒定與表達分析

范永勝, 程相杰, 董彥琪, 馬華平, 蔣志凱

(河南省新鄉市農業科學院, 河南 新鄉 453003)

半胱氨酸(Cystatin,Cys)蛋白酶抑制劑是廣泛存在于各種動植物體內的一類蛋白[1]。Cys的主要功能是通過直接與半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)活性位點結合來發揮抑制CP活性的作用,一般情況下這個過程是可逆的[2]。在植物中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑被命名為PhyCys(Phytocystatins),大多數PhyCys已被證明其主要抑制C 1 A家族CP的水解活性[3]。PhyCys屬于小分子蛋白,其分子量一般在11～16 kD之間,除此之外一部分PhyCys的分子量在23～30 kD之間,這是因為它們C端較長,有研究表明這類PhyCys不僅能抑制C 1 A類CP的活性,還可以抑制C 13類CP的活性[4]。

PhyCys在植物中發揮的功能是多樣的,如參與植物生長的調控[5]、參與生物脅迫防御反應[6]、響應非生物脅迫[7-8]等。PhyCys在模式植物擬南芥中進行了較為深入的研究,在擬南芥發生超敏反應(Hypersensitivity,HR)時AtCYS1的表達量迅速上升,在煙草中異位過表達AtCYS1時,可以明顯發現壞死斑面積的減少,說明AtCYS1的表達可以有效抑制HR的發生[9];ABA處理萌發過程中的擬南芥種子后,AtCYS6的表達量顯著增加,導致擬南芥種子萌發延遲,AtCYS6缺失突變體和過表達植株則分別表現為萌發提前與萌發延遲,種子萌發快慢與AtCYS6的表達量負相關[10]。大白菜Cys基因在擬南芥中進行異位過表達后同樣表現出種子延遲萌發的表型[11]。AtCYS除了參與擬南芥生長發育與防御的調控外,還參與響應非生物脅迫的過程,AtCYSa與AtCYSb的過表達植株對冷、干旱、高鹽環境的抵抗力顯著增強[12]。在玉米中,玉米瘤黑粉病侵染植株后半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因CC9高度表達,CC9通過抑制半胱氨酸蛋白酶的活性來抑制水楊酸(SA)介導的防御通路從而影響HR的產生,CC9基因沉默植株對瘤黑粉病抗病性大幅提高[13]。在水稻中,將水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因OC-I在煙草中異位表達后,顯著提高植株對煙草蝕紋病毒與馬鈴薯病毒的抗性[14]。對從楊樹品種河北楊中克隆的半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因進行體外表達后,發現其能夠有效抑制天牛的生長發育,抑制程度與半胱氨酸蛋白酶抑制劑的濃度呈正相關[15]。以上研究結果表明,PhyCys在植物的生長發育、參與生物脅迫的防御反應、響應非生物脅迫發揮著舉足輕重的作用。

PhyCys被證實已在多種植物中發揮著重要的作用[16],但尚未見到有關小麥TaCys家族相關基因深入的研究。本研究在小麥全基因組水平上,對TaCys的基因結構、染色體定位、啟動子順式作用元件及在生物與非生物脅迫下的基因表達進行了詳細的探討,為現代生物技術改良小麥品種與創新種質提供理論基礎,對提高小麥產量與抵抗病蟲害能力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 小麥TaCys基因家族的鑒定

在Ensembl plant (http://plants.ensembl.org/index.html)網站下載小麥基因組序列文件(Triticum_aestivum.IWGSC.dna.toplevel.fa)、GFF 3文件(Triticum_aestivum.IWGSC.49.gff 3),蛋白序列文件 (Triticum_aestivum.IWGSC.pep.all.fa)。通過Pfam蛋白家族數據庫(http://pfam.xfam.org/)獲取Cys基因家族隱馬氏模型文件(PF 00031),利用Hummer search軟件在小麥全基因組水平上鑒定獲得TaCys基因家族候選基因(E-value<1×10-5)。以水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑(OC)蛋白序列為參考序列,利用TBTools的Blastp功能在小麥全基因組水平上鑒定TaCys候選基因。將Hummer search與Blastp獲取的候選基因去除冗余后,在NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)與SMART(http://smart.embl.de/smart/batch.pl)網站手動鑒定Cys結構域的完整性,最終獲得TaCys家族基因。將小麥TaCys蛋白序列上傳到Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)預測小麥TaCys蛋白的等電點與分子量,在Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預測小麥TaCys基因的亞細胞定位。

1.2 小麥TaCys蛋白的系統發育進化樹分析

在Ricedate(https://www.ricedata.cn/gene/)網站獲得水稻OC家族的蛋白序列文件,利用MAGA 7.0軟件中的Clustal W工具,將水稻OC蛋白序列與新鑒定的小麥TaCys蛋白序列進行比對,采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構建系統發育進化樹(參數Bootstrap為1000),并利用iTOL在線工具(https://itol.embl.de/)對進化樹進行美化。

1.3 小麥TaCys基因結構與保守motif分析

將小麥TaCys蛋白序列上傳到meme (http://meme-suite.org/),對TaCys蛋白的保守基序進行鑒定(默認參數)。利用小麥gff 3文件通過TBtools軟件對小麥TaCys基因結構可視化。

1.4 小麥TaCys染色體定位

從IWGSC RefSeq V 1.0數據庫(https://urgi.versailles.inra.fr/)獲得TaCys基因的物理和染色體位置。根據各基因的起始位置和染色體長度,利用TBTools軟件繪制染色體定位圖譜。

1.5 小麥TaCys基因啟動子順式作用元件分析

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網站對小麥TaCys基因ATG上游2 000 bp的序列進行分析,對獲取的數據進行整理后利用TBTools軟件可視化。

1.6 小麥TaCys基因在不同小麥組織中的表達預測

利用小麥表達數據庫expVIP(http://www.wheat-expression.com/),獲得了TaCys家族基因在小麥植物根、葉、穗粒組織中的表達模式,預測了TaCys基因在不同階段的表達情況。利用Tbtools軟件繪制TaCys基因表達的熱圖。

1.7 小麥TaCys基因在生物與非生物脅迫下的表達預測

利用Genevestigator(https://genevestigator.com/)軟件獲取本研究所利用的生物與非生物脅迫下的小麥轉錄組數據,本地分析后進行可視化。

2 結果與分析

2.1 TaCys基因家族的鑒定及分類

將Hummer search與BlastP search 兩種方法獲取的候選蛋白序列進行比對后,去除冗余的序列,通過NCBI-CDD數據庫對Cys結構域的完整性進行手動確認,最終獲得了70個含有完整Cys結構域的小麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因TaCys,分別將其命名為TaCys1-A～TaCys42-D(表1)。對TaCys基因家族蛋白的理化性質分析后發現:TaCys基因家族蛋白的氨基酸長度區間在113～248 aa;其蛋白分子量在Expasy進行計算后發現,大部分TaCys的蛋白分子量在11～19 kD之間,只有TaCys10-A、TaCys 10-B、TaCys 10-D的分子量達到了26 kD左右,這是因為它們有較長C端[4];蛋白質等電點在4.72～10.16之間;亞細胞定位預測所有的TaCys蛋白都定位于細胞質中。

表1 TaCys基因家族的特性Table 1 The characteristics of TaCys gene family

小麥與水稻都是禾本科單子葉作物。本研究對70個小麥、8個水稻的Cys家族蛋白序列進行了比對,構建了系統進化樹。根據前人對水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因的研究結果,TaCys可以被分為三大類:Group A、GroupB、Group C。Group C含有最多的成員,包含42個基因,Group A與Group B則含有相同的成員數,都包含14個基因(圖1)。

圖1 小麥、水稻Cys家族系統進化樹分析Fig.1 The phylogenetic tree of the Cys family of wheat and rice

2.2 保守基序(motif)與基因結構分析

本研究利用在線網站MEME對TaCys的motif進行預測,結果如圖2所示。同一組且進化關系較近的基因的基序結構基本相似,motif基本按照9-7-3-1-2-6-4-5-10的順序分布。motif 1、motif 4、motif 5極其保守,幾乎出現在所有的TaCys中。為深入探究TaCys的基因結構特征,利用TBtools軟件對70個TaCys的基因結構進行可視化(圖2)。同一組內基因的外顯子和內含子數量基本相同,TaCys基因包含0～3個內含子和1～4個外顯子。A組中TaCys基因所含內含子與外顯子的數量總體最多,其中TaCys10-A、TaCys10-B、TaCys10-D均含有3個內含子和4個外顯子,在所有已鑒定到的TaCys中數量最多。TaCys9-A、TaCys9-B、TaCys9-D的數量則次之,含有2個內含子和3個外顯子。B組與C組中除了TaCys21-B與TaCys4-D含有2個內含子外,其他TaCys只有1個外顯子。內含子的數目與長度決定了小麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因的大小。

圖2 TaCys基因家族的保守motif與基因結構Fig.2 Conservation motifs and gene structure of TaCys gene family

2.3 TaCys基因在小麥染色體上的分布

TaCys基因分布在小麥的19條染色體上(圖3),其物理位置如表1所示。70個TaCys基因在染色體上呈現出不均勻分布的情況,絕大部分分布在染色體的兩端,只有TaCys11-A、TaCys11-D分布在染色體的著絲粒處。其中1 A、6 B、7 B、6 D染色體上有1個基因成員;4 A、7 A、1 B、7 D染色體上有2個基因成員;3 A、5 A、4 B上有3個基因成員。TaCys基因在2 A、3 B、3 D、3 D、4 D、5 D染色體中的分布相對平衡,在2 B染色體上含有最多的基因成員達到13個。基因的串聯重復是基因家族增大的機制之一[17],本研究鑒定到9組串聯重復基因簇,分別是TaCys3-A/TaCys7-A/TaCys8-A/TaCys19-A;TaCys15-A/TaCys17-A;TaCys27-B/TaCys28-B/TaCys29-B/TaCys30-B/TaCys31-B/TaCys32-B/;TaCys8-B/TaCys7-B/TaCys3-B/TaCys24-B/TaCys25-B/;TaCys23-B/TaCys21-B/TaCys21-B/TaCys22-B/;TaCys38-D/TaCys3-D/TaCys7-D/TaCys8-D;TaCys35-D/TaCys36-D/TaCys37-D;TaCys39-D/TaCys40-D/TaCys5-D;TaCys15-D/TaCys17-D/TaCys33-D/TaCys12-D,這可能是TaCys基因家族成員數量多于其他植物Cys基因家族的原因。

圖3 TaCys基因家族在小麥染色體上的分布Fig.3 Distribution of TaCys gene family on chromosomes

2.4 TaCys的啟動子順式作用元件分析

植物通常通過調控自身的轉錄速率來適應脅迫[18]。基因的順式作用元件是激活或抑制轉錄因子的結合位點[19],一些啟動子順式作用元件是許多基因所共有的,比如光響應作用元件。本研究發現,每個TaCys都含有大量的光響應元件(圖4),其中,TaCys10-B、TaCys24-B、TaCys25-B、TaCys37-D、TaCys2-D、TaCys4-D、TaCys19-A含有20個以上的光響應元件,說明這些基因可能在光響應通路發揮著關鍵作用。TaCys還含有大量的激素相關作用元件,ABA可以抑制種子的萌發,AtCys6上含有大量的ABA相關的順式作用元件,ABA處理過的種子,種子萌發延遲,AtCys6的表達量上調,半胱氨酸蛋白酶活性降低[10]。TaCys10-B、TaCys10-D、TaCys24-B、TaCys4-D都含有10個以上的ABA響應通路相關作用元件,它們可能發揮與AtCys6相似的功能,與小麥種子的萌發有關。外施MeJA能夠誘導植物中半胱氨酸蛋白酶抑制劑的分泌且誘導植物防御基因的表達,表現出對病害的抗性作用[20-21]。TaCys10-A、TaCys10-B、TaCys10-D、TaCys15-D、TaCys21-B、TaCys22-B、TaCys34-D、TaCys37-D、TaCys4-D、TaCys8-A、TaCys10-B、TaCys16-B、TaCys26-B含有10個以上的MeJA通路相關的作用元件,它們可能在小麥面對生物脅迫時發揮重要作用。TaCys除含有光響應作用元件與激素相關作用元件外,還含有植物生長發育與非生物脅迫相關的作用元件,說明TaCys在小麥中發揮的功能可能是多樣的。

圖4 TaCys基因家族啟動子區順式作用元件分析Fig.4 Analysis of cis-acting elements in promoter region of TaCys gene family

2.5 TaCys在小麥組織中表達模式分析

本研究利用現有的小麥RNA-seq數據庫expVIP,分析了TaCys基因在小麥不同發育階段(幼苗期-Seedling-S、營養生長期-Vegetative-V、生殖生長期-Reproductive-R)的不同組織(根、葉、穗和粒)中的表達模式(圖5)。A組中,除TaCys15-A、TaCys15-D、TaCys17-A、TaCys17-D外,有10個TaCys(TaCys9-A、TaCys9-B、TaCys9-D、TaCys10-A、TaCys10-B、TaCys10-D、TaCys33-D、TaCys34-D、TaCys14-B、TaCys14-D)在小麥不同組織的不同發育階段中均表現為持續高表達,表明他們可能在小麥生長發育的各個階段都發揮著功能。B組與C組中,TaCys1-A、TaCys1-D在小麥不同組織的不同發育階段中表達,TaCys11-A、TaCys11-B、TaCys11-D在根與幼苗期的葉子中表達,26個TaCys(TaCys18-A、TaCys20-B、TaCys23-B、TaCys35-D、TaCys37-D、TaCys2-D、TaCys3-A、TaCys3-B、TaCys3-D、TaCys6-A、TaCys6-B、TaCys6-D、TaCys7-B、TaCys8-A、TaCys8-B、TaCys8-D、TaCys12-A、TaCys13-A、TaCys13-D、TaCys19-A、TaCys26-B、TaCys27-B、TaCys31-B、TaCys32-B、TaCys39-D、TaCys41-D)只在生殖生長期籽粒中表達,在根、葉、穗中基本不表達,說明這些基因可能與籽粒灌漿有關。

圖5 TaCys基因在不同發育階段不同組織中的表達分析Fig.5 Expression analysis of TaCys genes in different tissues at different developmental stages

2.6 生物與非生物脅迫下TaCys的表達譜分析

本研究利用公共基因表達數據分析系統Genevestigator對生物與非生物脅迫下TaCys的表達譜進行了分析,包括6種處理:小麥白粉病病原菌(B.graminis)、小麥赤霉病病原菌(F.graminearum)、激發子Flg 22與Chitin、干旱、冷、熱(圖6)。在接種小麥白粉病后,14個TaCys(TaCys9-A、TaCys9-B、TaCys9-D、TaCys10-A、TaCys10-B、TaCys10-D、TaCys33-D、TaCys34-D、TaCys14-B、TaCys14-D、TaCys9-B、TaCys1-A、TaCys1-B、TaCys1-D)的表達量上調,其中TaCys34-D對小麥白粉病的響應最為強烈。在接種小麥赤霉病后,4個TaCys(TaCys23-B、TaCys35-D、TaCys37-D、TaCys1-D)的表達量明顯上調,TaCys35-D與TaCys37-D對小麥赤霉病的響應最為強烈。激發子能夠激活植物的免疫反應PTI過程(病原相關分子模式觸發的免疫)[22],小麥在chitin和flg 22誘導下,5個TaCys(TaCys23-B、TaCys35-D、TaCys37-D、TaCys1-A、TaCys41-D)持續高表達,這證明它們可能參與植物免疫中PTI的過程。在非生物脅迫中,6個TaCys(TaCys9-A、TaCys9-B、TaCys9-D、TaCys17-A、TaCys17-D、TaCys34-D)在冷、熱脅迫下都表現為下調;5個TaCys(TaCys10-A、TaCys10-B、TaCys10-D、TaCys14-B、TaCys14-D)在冷、干旱脅迫下都表現為上調;4個TaCys(TaCys11-A、TaCys11-B、TaCys11-D、TaCys41-D)在干旱脅迫下表現為持續下調。這些數據表明,TaCys可能在小麥生長發育和面對不同脅迫時都發揮著重要作用。

圖6 不同脅迫處理下TaCys的表達水平Fig.6 Expression level of TaCys under different stress treatments

3 討論與結論

了解TaCys基因的生物學功能及其對生物與非生物脅迫響應的分子機制,有助于培育多抗高產小麥新品種。Cys基因在許多物種中都有報道,然而,由于小麥基因組的復雜性,對小麥Cys基因家族的研究還不夠深入。

本研究共鑒定了70個TaCys基因,并將其分為3組。C組是小麥家族中最大的群體,占家族成員總數的50%,且C組成員的基因結構中都含有多個內含子,B組與C組中幾乎所有成員只含有1個內含子,這與擬南芥[9]、水稻[1]等物種中Cys基因家族中的結果一致,說明Cys在不同物種進化中具有保守性,不同物種的Cys同源基因在植物生長發育調控和面對脅迫響應時可能發揮著相同的作用。基因串聯復制事件被認為是增加基因家族多樣性的關鍵機制[17]。本研究將TaCys基因的染色體定位進行了可視化,70個TaCys被定位到19條小麥的染色體上。在植物進化過程中,基因串聯復制事件經常發生,導致基因家族的擴展。如果一個200 kb以內的染色體區域包含2個或2個以上的基因,則該區域的基因被認為是串聯重復事件的結果[23]。9個串聯重復事件共包含35個TaCys基因,結果表明,TaCys基因家族的擴增是進化過程中基因串聯復制事件發生的結果。

基因表達受到許多順式作用元件的調節,先前的研究已經證實,PhyCys基因對不同的誘導都有響應,如寒冷、ABA、干旱和光照誘導[8,12,24],然而,對TaCys基因啟動子順式作用元件的研究很少。對TaCys基因的啟動子分析揭示了各種應激響應元件的存在,如ABA、干旱響應、防御和應激響應以及厭氧誘導元件等。結合本研究中對TaCys在非生物脅迫下表達譜分析的結果,TaCys10-A、TaCys10-D、TaCys14-B可能在植物冷與干旱逆境脅迫下發揮著重要的作用。

病原菌在侵染植物時能引起PhyCys基因表達上調,暗示PhyCys與植物抗病防御有關[25]。植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑通過抑制菌絲生長起到抗病的作用,其機理可能是抑制真菌半胱氨酸蛋白酶的活性[26]。本研究中對TaCys響應小麥白粉病(活體營養型病原菌)與赤霉病(死體營養性致病菌)的表達情況進行了分析(圖5),TaCys在病原真菌侵染后,可通過抑制病原真菌體內的半胱氨酸蛋白酶活性來達到抗病的作用,14個TaCys只在接種白粉病后表達上調,4個TaCys只在接種赤霉病后表達上調,說明TaCys在防御不同營養型病原菌入侵時具有特異性。TaCys35-D、TaCys37-D不僅在赤霉病誘導下表達上調,flg 22與chitin也能誘導它們的表達,這可能是小麥感染赤霉病后TaCys35-D、TaCys37-D能激活PTI反應,增強小麥的抗病性。

TaCys在小麥中發揮不同生物學功能的機制尚不清楚,深入研究并揭示其潛在機制能夠更加全面地認識小麥生長發育與抗病害的機制。因此,明晰TaCys在植物中的表達調控機制,有助于后期利用分子育種等手段創新種質與培育高產高抗小麥品種。