大腸埃希菌臨床株QD24對黏菌素和碳青霉烯類耐藥的機制

王曉慧,賈 楠,王 笑 ,2,姜美妍,朱元祺,2*

(1.青島大學附屬醫院,山東 青島266003;2.青島大學醫學部,山東 青島266071; 3.淄博市張店區人民醫院,山東 淄博266034)

新德里金屬-β-內酰胺酶(NDM)是最常見的碳青霉烯酶,除了氨曲南外,對幾乎所有的β-內酰胺類抗生素具有水解作用。目前,包括blaNDM-1到blaNDM-48(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene/#NDM)在內的48個基因變體編碼NDM酶[1]。其中,blaNDM-13基因于2015年由Shrestha首次報道[2]。黏菌素是治療碳青霉烯耐藥細菌引起的感染的最后手段[3]。然而,質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1的出現引起了廣泛關注[4]。一旦mcr-1和blaNDM-13共存,這將威脅到碳青霉烯類耐藥菌的抗感染治療,但目前尚無同時攜帶這兩個基因的病原體的報道。因此,本文是對同時攜帶mcr-1.1和blaNDM-13耐藥基因的ST69型大腸埃希菌臨床分離株進行研究,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株大腸埃希菌臨床株QD24分離于2019年住院尿路感染患者的尿標本。脈沖場凝膠電泳的分子量標記為沙門菌H9812;儀器質控菌株為ATCC 25922和ATCC 700603;疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53AziR為質粒液相接合受體菌(E.coliJ53AziR)。以上菌株均為本實驗室保存。

1.2 儀器和試劑細菌鑒定和藥敏為VITEK 2 Compact 全自動系統,結果判定按照CLSI-M100-2021[5];碳青霉烯酶檢測卡為北京金山川公司生產;凝膠成像儀和脈沖場電泳(PFGE)系統為BIO-RAD公司。

1.3 S1核酸脈沖場凝膠電泳和Xba I脈沖場凝膠電泳具體操作步驟和結果解釋依據相關文獻報道的方法[6-7]。

1.4 液相接合試驗大腸埃希菌臨床株QD24與E.coliJ53AziR的液相接合操作步驟參照相關文獻進行[6]。

1.5 大腸埃希菌臨床株QD24的全基因組測序采用二代Illumina和三代Nanopore測序平臺以獲得QD24株的染色體和質粒序列,然后利用在線軟件,如ResFinder(4.1)和PlasmidFinder(2.1)等,分析該菌株的生物學信息。

2 結果

2.1 大腸埃希菌臨床株QD24的碳青霉烯酶篩檢和藥敏結果

經碳青霉烯酶檢測卡(北京金山川)檢測,大腸埃希菌QD24株產NDM型碳青霉烯酶。這株(QD24)菌除了對替加環素敏感外,對多黏菌素、碳青霉烯類、磷霉素、青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類和喹諾酮類等常用抗菌藥物耐藥,藥敏結果見表1。

表1 QD24株與其接合子和E.coli J53AziR的藥敏結果

2.2 大腸埃希菌臨床株QD24測序數據的分析

經Illumina和Nanopore技術平臺獲得QD24株的染色體和攜帶的質粒序列,經在線軟件分析結果為:①QD24株的多位點序列分型(MLST)為ST69(adk_21、fumC_35、gyrB_27、icd_6、mdh_5、purA_5和recA_4)。②該菌株攜帶了3個質粒,依大小分別命名為pQD24-1、pQD24-2和pQD24-3。③pQD24-1屬于IncHI2型質粒,除了攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1.1外,還攜帶多個類型的耐藥基因;pQD24-2為IncFIA/IncFIB 型雜合質粒,攜帶了超廣譜β-內酰胺酶耐藥基因blaCTX-M-55和其他多個耐藥基因;pQD24-3屬于IncB/O/K/Z型質粒,攜帶了碳青霉烯類耐藥基因blaNDM-13和 磷霉素耐藥基因fosA3。測序分析的詳細結果見表2。

表2 QD24株測序數據的生信分析結果

對Pubmed數據庫中有關blaNDM-13基因的報道和/或提交該基因序列的有關信息進行了分析。到目前為止,在已經提交6個序列(不包括本研究)中,blaNDM-13基因有5個位于質粒上,另外1個位于染色體上[2,8-10]。另外,在提交的序列中,僅有3個為完整的質粒環形序列(KX094555,CP092912和MN219406)[8,10],質粒大小分別為54 kb、88 kb和98 kb。本研究與已報道blaNDM-13基因的比較詳見表3。

表3 QD24株與提交的blaNDM-13基因序列的比較

2.3 液相接合試驗和接合子的鑒定及藥敏結果

為探討QD24菌株攜帶的質粒和耐藥機制,將供體菌QD24與受體菌E.coliJ53AziR進行液相接合試驗,成功地獲得了接合子,被命名為QD24-C。QD24-C的驗證:①藥敏表型,與QD24菌株比較,接合子QD24-C對氨曲南、多黏菌素顯示為敏感,而前者為耐藥。QD24、QD24-C和E.coliJ53AziR藥敏結果的比較詳見表1。②碳青霉烯酶檢測接合子QD24-C,提示產NDM酶。③ S1-PFGE顯示QD24攜帶3個質粒,其分子大小與測序數據pQD24-1、pQD24-2和pQD24-3的結果相一致,而接合子QD24-C攜帶1個與pQD24-3大小相同的質粒,S1-PFGE結果見圖1。④因為供體菌和接合子都是大腸埃希菌,為了避免接合子QD24-C可能是由大腸埃希菌QD24(盡管理論上該菌對疊氮鈉敏感)丟失了質粒而來,所以將這兩個菌進行Xba I酶切脈沖場凝膠電泳圖(PFGE)以檢測其同源性。依據規則[7]分析PFGE圖像,結果表明這兩菌無同源性,即QD24-C為獲得來自供體菌pQD24-3質粒的E.coliJ53AziR,PFGE結果詳見圖2。

圖1 S1核酸酶切脈沖場凝膠電泳圖(S1-PFGE)

圖2 Xba I酶切脈沖場凝膠電泳圖(PFGE)

上述結果提示,大腸埃希菌QD24可將攜帶blaNDM-13基因的pQD24-3質粒經液相接合傳遞到E.coliJ53AziR。但是,攜帶多黏菌素mcr-1.1基因的pQD24-1質粒卻不能經液相接合進行傳遞。

3 討論

碳青霉烯類和黏菌素是臨床治療多重耐藥革蘭氏陰性病原體感染的重要抗生素。本研究的大腸埃希菌QD24株除了對替加環素敏感外,對多黏菌素、碳青霉烯類、磷霉素、其他β-內酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類等常用抗菌藥物耐藥,呈現泛耐藥表型。另外,測序分析顯示QD24株攜帶了黏菌素耐藥基因mcr-1.1、磷霉素耐藥基因fosA3、編碼產碳青霉烯酶的基因blaNDM-13和超廣譜β-內酰胺酶基因blaCTX-M-55。此外,該菌還同時攜帶了多個耐藥相關基因,如氨基糖苷類和喹諾酮類,并且這些基因型與其耐藥表型相符合。

目前,編碼新德里金屬β-內酰胺酶(NDM)有48個blaNDM基因亞型[1],包括blaNDM-1到blaNDM-48。其中,blaNDM-13基因編碼的NDM-13酶是一種與NDM-1相比具有兩種氨基酸取代(D95N和M154L)的變體,導致對頭孢噻肟的水解活性增加[2]。迄今為止,在5株大腸埃希菌中檢測到NDM-13基因,分離自尼泊爾(1株)[2]、中國(3株)[8]和韓國(1株)[9]的菌株。另外,最近在中國福建廈門來源的1株沙門菌(Salmonella Rissen)中,也檢測到blaNDM-13基因[10]。與上述報道不同的是,本研究的ST69型大腸埃希菌QD24株除了攜帶blaNDM-13基因外,還同時攜帶黏菌素耐藥基因mcr-1.1。

黏菌素是治療由多重耐藥革蘭氏陰性細菌引起的感染的最后手段之一。然而,這種抗生素的廣泛使用導致了黏菌素耐藥的出現,這可能是染色體或質粒介導的。目前,人們已經認識到腸桿菌目細菌對黏菌素的抗性可能是由于染色體機制和(或)質粒攜帶的移動黏菌素抗性基因(mcr)[4,11]。質粒介導耐黏菌素歸因于mcr基因,包括mcr-1到mcr-10,其中mcr-1是最主要的mcr類型[11-12]。到目前為止,已經有34種mcr-1的等位基因變異體,從mcr-1.1變體到mcr-1.34(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene/#MCR)。質粒中發現的mcr-1基因屬于不同的不相容組(IncI2,IncHI2,IncP,IncX4,IncFI,IncFIB),這介導了它們可以向不同細菌物種的水平轉移。本研究的大腸埃希菌QD24中的pQD24-3質粒(攜帶有blaNDM-13基因)可經液相接合傳遞到受體菌E.coli J53AziR,但攜帶mcr-1.1基因的pQD24-1質粒卻不能經液相接合傳遞(該質粒屬于IncHI2不相容組),這提示QD24菌株對黏菌素和碳青霉烯類抗生素的耐藥可能是由于該菌攜帶了mcr-1.1基因并獲得了一個外源性攜帶blaNDM-13基因的質粒pQD24-3,但這需進一步研究。

質粒介導的耐黏菌素mcr基因的不同亞型(mcr-1到mcr-10)或亞型的等位基因變異體(從mcr-1.1到mcr-1.34)與編碼新德里金屬β-內酰胺酶的blaNDM基因的不同亞型(blaNDM-1到blaNDM-48)可以共存于引起人體感染的同一個病原體[1]。除了感染病原體外,也可以從食物來源的細菌中發現這兩個耐藥基因的共存,如,Wang 等于2022年報道從肉食分離的大腸埃希菌中檢測到mcr-1 和blaNDM-5 基因[13]。另外,有研究發現人體定植菌可同時攜帶這兩個耐藥基因,如Liang 等從人體腸道中分離到攜帶NDM-9 和 mcr-1基因的ST1011型大腸埃希菌[14]。以上表明,耐黏菌素mcr基因與碳青霉烯類耐藥blaNDM基因共表達的細菌已經在環境、食品和人體以及動物中分布。然而,經數據庫檢索,同時攜帶mcr-1.1和blaNDM-13耐藥基因的細菌尚未見報道。

綜上所述,本研究的ST69型大腸埃希菌QD24臨床株對黏菌素和碳青霉烯類耐藥是因為該菌同時攜帶了mcr-1.1和blaNDM-13耐藥基因,并且這兩個基因位于不同的質粒上。