應用質譜法和顯色培養法對真菌血流感染鑒定的比對研究

宋伶俐,李密陽,馬琳琳*

(1.北華大學附屬醫院 檢驗科,吉林 吉林132011;2.吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科,吉林 長春133033)

近年來,隨著激素、廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛應用,真菌引起的血流感染日漸增多。念珠菌是真菌血流感染最常見的病原菌,并且真菌感染比細菌感染死亡率更高,治療效果也相對更差[1]。為了降低血流感染的發病率和死亡率,早期有針對性的抗菌藥物治療是關鍵,故臨床對真菌的快速準確鑒定成為目前迫切解決的問題。最近幾年病毒感染繼發肺部感染入住重癥監護病房(ICU)的患者,進而繼發性合并真菌性敗血癥也有所增加,這種繼發感染導致了預后不良和病死率的增加。另有研究顯示,致病真菌的種類也有所增加,故臨床對真菌引起的血流感染的快速診斷至關重要[2]。

臨床實驗室的微生物鑒定依賴于傳統生化反應和基因測序技術等,特點是耗時長或成本高。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF MS)的發展,引入了一種快速簡單高效成本低的方法,改變了微生物的常規鑒定方法[3]。質譜法(VITEK MS)是基于MALDI-TOF技術,用于臨床分離的細菌、酵母樣真菌、絲狀真菌等的快速鑒定。本研究將血培養報陽后采用培養后質譜法、分離膠處理后質譜法,培養后顯色法和直接顯色法,4種方法進行鑒定并進行對比研究,評價了這些方法在臨床應用中的價值,為臨床真菌鑒定選取合適方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2022年1月至2022年6月北華大學附屬醫院無菌部位培養的念珠菌共150株。包括白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、新生隱球菌。菌株為ITS測序確認菌株。真菌血流感染采用建模方式進行實驗。

1.2 試劑和儀器

全自動血培養儀(美國BD公司);含樹脂需氧血培養瓶(美國BD公司);甲酸、乙腈(法國梅里埃);血瓊脂平板和沙保弱瓊脂平板(鄭州安圖);Vitek MS質譜儀(法國梅里埃);分離膠促凝管(INSEPACK)。

1.3 標準菌株

白色念珠菌ATCC14053,近平滑念珠菌ATCC22019。

1.4 真菌建模方法

將白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等配制成0.5 麥氏濃度的菌液,取菌液1 ml注入到需氧培養瓶中,取8 ml羊血注入瓶中,放入血培養儀中進行增菌培養,儀器報陽后用相應方法進行鑒定。

1.5 血培養常規鑒定

血培養瓶報陽后采用分離膠處理方法進行質譜鑒定,記錄結果;轉種沙氏培養基培養孵育18～24 h后質譜鑒定,記錄結果;轉種顯色培養基常規培養,培養孵育18～24 h后,記錄顯色培養基的結果;轉種沙氏培養基養孵育18～24 h,培養后菌落再進行顯色培養18～24 h后,記錄顯色結果。

1.6 分離膠促凝管預處理血培養瓶直接質譜鑒定[4]

1.6.1血培養瓶內容物,抽取5 ml至普通分離膠促凝管,900 r/min水平室溫離心10 min,棄去上清,見分離膠表層灰白色菌體富集物。

1.6.2500 μl無菌注射用水,加入1.5 ml離心管中備用,挑取上述灰白色菌體富集物,加入500 μl無菌水中,12 000 r/min,離心2 min,用無菌槍頭吸取上清棄去,加入500 μl無菌水懸浮并充分振蕩混勻,12 000 r/min,離心2 min,留沉淀重復洗滌步驟1次。

1.6.3取1份菌體富集物,棄去上清,加入500 μl 75%乙醇(依菌量定)懸浮并振蕩混勻,12 000 r/min,離心2 min。

1.6.4用移液器將上清(乙醇)吸取并棄去,12 000 r/min,離心2 min。

1.6.5室溫開蓋放置數分鐘晾干去除乙醇(殘留乙醇會影響質譜峰,盡量完全干燥),向晾干的離心管中加入20 μl 30%甲酸(依菌量而定)振蕩混勻,再加入等量乙腈,12 000 r/min,離心2 min。

1.6.6取離心后的上清液1 μl點至靶板并室溫晾干,待樣本干燥后加入1 μl基質液,進行質譜檢測。

1.7 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析。統計分析采用χ2檢驗、Fisher確切概率檢驗或非參數檢驗,以P<0.05有差異有統計學意義。

2 結果

2.1 顯色培養鑒定結果

血培養瓶報陽后,直接用顯色培養基轉種培養和用沙氏培養基轉種后再顯色鑒定,得出的結果是一致的。顯色培養基僅能鑒定4種常見念珠菌,故實驗中選用的20株不常見真菌無法給出鑒定結果,顯色鑒定與基因測序結果一致的共有101株,鑒定準確率為77.69%(101/130)。顯色結果與基因測序結果不一致發生率最高的是熱帶念珠菌,有12株與基因測序不同,達48%(12/25),其次依次是克柔念珠菌30%(3/10)、白色念珠菌15.56%(7/45)、光滑念珠菌14%(7/50)。

近平滑念珠菌在顯色培養中有7例顯色為紫色,誤認為是光滑念珠菌,3株無色無法鑒定;葡萄牙念珠菌有4株顯紫色,誤認為是光滑念珠菌,2株無色無法鑒定;白色念珠菌與熱帶念珠菌也可顯紫色,共14株誤認為光滑念珠菌。新生隱球菌顯白色無法鑒定。見表1。

表1 培養后顯色和直接顯色結果(株)

2.2 質譜鑒定結果

血培養瓶報陽后,轉種沙氏培養基培養后質譜,與基因測序的一致率是96.6%(145/150),有5株質譜沒有給出鑒定結果。采用分離膠直接質譜僅鑒定出7株真菌,與基因測序的一致率為4.67%(7/150)。1株光滑念珠菌錯誤的鑒定為挪威畢赤酵母菌、1株克柔念珠菌無法鑒定;2株葡萄牙念珠菌有1株鑒定為釀酒酵母菌、1株無法鑒定;1株新生隱球菌無法鑒定。分離膠直接質譜鑒定有143株無法鑒定無結果,原因主要為所得質譜譜峰不夠。見表2。

表2 培養后質譜和分離膠后質譜結果(株)

2.3 顯色鑒定與質譜鑒定比較

分離膠直接質譜其鑒定效率最高,出結果用時最短,但準確率最低。培養后質譜鑒定用時和直接顯色鑒定用時相同,但準確率存在差異,并且P<0.05,差異有統計學意義。培養后顯色鑒定與直接顯色培養鑒定一致,準確率無差異,但用時直接顯色鑒定要提前24 h。另外顯色鑒定無法給出少見菌和不典型顯色的菌株的鑒定結果。故4種方法比較,兼顧時間和準確率最優的方法為培養后質譜鑒定。見表3。

表3 鑒定結果所用時間、準確率比較

3 討論

全球流行的深部真菌感染,尤其是血流感染,以念珠菌為主,病死率非常高,ICU住院患者,病死率可高達40%[5]。新生隱球菌也是血流感染可見病原體之一[6]。病毒感染、激素、免疫抑制劑的使用也增加了ICU病人的感染風險。近期報道的阿薩西毛孢子菌引起的血流感染病死率可高達86%,其他真菌從45%～90%不等,病毒感染的病人,自身微生態失調,增加了微生物易位的風險,可能為病原體的主要來源[7]。真菌感染的高死亡率決定著其早期診斷的重要性,真菌血流感染診斷的現狀遠遠無法滿足臨床對于血流感染早期診斷的需求。而快速準確的識別病原菌并且正確初始的抗生素治療,對于膿毒血癥尤為重要,早期適當的接受抗生素治療的患者可以降低死亡率并改善臨床預后。目前臨床上血培養仍然是診斷血流感染的金標準[8]。臨床微生物實驗室真菌鑒定方式主要有顯色鑒定、手工鑒定、質譜鑒定、儀器鑒定、分子生物學鑒定等方式,其中全自動微生物分析系統和顯色鑒定為主要方法,有報道比較了質譜和全自動微生物分析系統真菌鑒定的一致性達80%[9],比較了手工鑒定和顯色鑒定的準確率[10]。本研究比較了質譜技術和顯色鑒定的一致性和準確率,對真菌血流感染報陽后直接顯色鑒定和分離膠處理后質譜鑒定進行了研究,結果表明,質譜鑒定優于顯色鑒定,血培養報陽后經分離膠處理直接質譜鑒定的準確率還有待提高。

從本研究的結果可以看出,如果是無菌部位的真菌感染,尤其是血流感染,建議準確鑒定到種,不建議采用顯色方法,因顯色方法的準確率僅為77.69%,顯色中的錯誤發生率最高的是熱帶念珠菌。其次依次是克柔念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌,有很多其他念珠菌容易被錯誤鑒定為光滑念珠菌。但值得注意的是顯色培養后的菌落并不影響質譜鑒定的準確性[11]。采用培養后質譜鑒定,對于酵母樣真菌的準確率達96.6%,相比全自動微生物分析系統,質譜更加快速準確,可提前24 h,對于罕見菌和少見真菌的鑒定準確率也更高[12]。

本研究對血流感染報陽后分離膠處理后直接鑒定對真菌鑒定提供了新思路,此方法1 h就可以鑒定出結果,但是準確率太低,多數都無法鑒定出結果,原因為無法獲得譜峰,這可能由于真菌報陽后不能達到質譜所需菌量或者由于富集方法無法大量集菌,也可能由于真菌細胞壁較厚,破壁技術不夠完善,后續方法有待改進,可嘗試短時固相/液相培養方法進行改進[13],值得后續繼續研究。另外,血流感染后直接顯色鑒定培養與培養后顯色鑒定,其結果是一致的,對于沒有質譜技術的醫院,為縮短鑒定時間不失為一種新思路,但由于顯色鑒定的準確率不高,所以后續仍需用可靠方法鑒定到種,但可以為臨床提供初步診斷的證據,作為一種基礎初步替代方法在縮短鑒定時間上也行之有效。

綜上所述,培養后質譜鑒定法在時間和準確性上為較優方法,對于血流感染以及深部感染的真菌,可采用此方法,可為臨床的早期診斷提供依據。血流感染報陽性后經分離膠處理后利用質譜技術直接進行鑒定,此方法還有待進一步研究,以便能夠為臨床提供更加快速的可靠的鑒定方法。