大蒜素對MPP+所致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

楊傳彬,韓曉彬,秦小嬌,楊嘉君

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,上海200233)

帕金森病在神經(jīng)退行性疾病中是比較常見的,其發(fā)病機制和多巴胺能神經(jīng)元的選擇性死亡、黑質(zhì)缺失以及細(xì)胞內(nèi)Lewy小體的形成有關(guān)[1-2]。到目前為止,帕金森病的病因尚不十分清楚。但有證據(jù)表明,衰老、自身免疫、毒性物質(zhì)以及氧化應(yīng)激等與其發(fā)病機理息息相關(guān)[3-4]。在這些影響因素中,導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性的關(guān)鍵因素是氧化應(yīng)激,這是由于在細(xì)胞中氧自由基的產(chǎn)生和清除失衡,使活性氮(RNS)和活性氧(ROS)等物質(zhì)造成的氧化損傷[5]。ROS可引起脂質(zhì)過氧化、基因突變和蛋白質(zhì)變性,亦可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡[6]。1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)可以使ROS的產(chǎn)生增加,引起線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[7-9]。因此,應(yīng)用MPP+所致的PC12細(xì)胞功能障礙和凋亡可以作為研究氧化應(yīng)激引起的帕金森病的有效模型。

大蒜素是大蒜的主要生物活性成分,具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗衰老、抗菌、抗高血壓和抗動脈粥樣硬化作用[10-13]。大蒜素可以通過促進(jìn)抗氧化物的產(chǎn)生,降低細(xì)胞毒副產(chǎn)物以及游離氧自由基的吸收[14]。同時也具有神經(jīng)保護(hù)作用,通過啟動氧化應(yīng)激和凋亡程序來保護(hù)細(xì)胞免受缺血性神經(jīng)損傷[15-16]。也有研究報道[17],大蒜素可以通過影響內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)和線粒體功能來保護(hù)6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PD相關(guān)的神經(jīng)元損傷。但大蒜素對氧化應(yīng)激損傷引起的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機制,目前尚不完全清楚。

因此,本研究采用MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立體外神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷和凋亡模型,同時觀察大蒜素對神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化,探討大蒜素對神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用的細(xì)胞凋亡調(diào)控機制,以期為神經(jīng)保護(hù)的可能信號通路以及帕金森病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購于ATCC細(xì)胞庫;大蒜素購自國家藥品生物制品檢驗所(北京);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素和胰蛋白酶均購于Gibco公司;MTT試劑盒購于索萊寶公司;SOD、MDA試劑盒購于南京建成生物科技有限公司;ROS檢測試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于翊圣公司;BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天公司;Bcl-2抗體、Bax抗體、Cleaved-caspase 3抗體、Cyt C抗體以及β-Actin抗體均購于Abcam公司。

1.2 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)與分組

1.2.1PC12細(xì)胞的培養(yǎng)

PC12細(xì)胞為貼壁細(xì)胞,用含10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液,在5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,1～2 d傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2PC12細(xì)胞的實驗分組

實驗分組:對照組、模型組(4 mM的MPP+處理組)、實驗組即4 mM的MPP+與不同濃度的大蒜素(0.01、0.1和1 μg/mL)的聯(lián)合培養(yǎng)組。

1.3 MTT法檢測大蒜素對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖活力的影響

將對數(shù)生長期細(xì)胞以5×104/ml接種于96孔板,每孔加入100 μl 細(xì)胞懸液,每組6個平行孔,37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞貼壁后,每孔加入4 mM的MPP+新鮮培養(yǎng)液,實驗組加入大蒜素,使其終濃度分別為0.01、0.1和1 μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,空白組和對照組除不給予MPP+處理及不加入藥物外,其他處理同上。吸去舊培養(yǎng)液,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液,孵育4 h后采用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定各孔的OD值。實驗重復(fù)3次,細(xì)胞相對存活率(%)=(實驗組平均吸光度值-空白組平均吸光度值)/(對照組平均吸光度值-空白組平均吸光度值)×100%。

1.4 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平檢測

1.4.1ROS含量檢測

PC12細(xì)胞以密度5×105/mL,每孔250 μL接種于24孔板中,細(xì)胞貼壁后按照實驗分組處理后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h,之后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞中ROS的含量。

1.4.2生化指標(biāo)SOD、MDA活性的檢測

PC12細(xì)胞以密度5×105/mL,每孔250 μL接種于24孔板中,細(xì)胞貼壁后按照實驗分組處理后于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h,根據(jù)試劑盒的要求提取細(xì)胞總蛋白質(zhì),并測定細(xì)胞中SOD和MDA的含量。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞制成 5×105/mL的細(xì)胞懸液接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞貼壁后,按上述實驗分組加處理因素,5% CO2、37℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,收集各組細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,加入100 μL 1× Binding Buffer吹打混勻,之后每個樣品加入5 μL AnnexinV-FITC(20 μg/mL)和5 μL PI(50 μg/mL),同時以不加AnnexinV-FITC 和PI的空白管作為陰性對照,室溫下避光20 min,之后加入400 μL Binding buffer,混勻后立即用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量檢測。

1.6 Western blot檢測

將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞按照5×105/mL的密度接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞貼壁后,按照實驗分組要求給予不同處理,24 h后提取細(xì)胞總蛋白。各取10 μl樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),之后轉(zhuǎn)移到0.25 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5% BSA室溫?fù)u床封閉2 h。隨后分別加入Cyt C抗體和凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3抗體,以β-Actin抗體作為內(nèi)參蛋白,4℃過夜。用Tris-鹽酸緩沖液(TBST)(含0.05% Tween-20)洗膜3次,10 min/次。再加入相應(yīng)的辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記的二抗,于搖床室溫孵育1 h,TBST洗10 min×3次。化學(xué)發(fā)光液(ECL)1∶1配制后用化學(xué)發(fā)光儀檢測,采用Image J軟件分析各目的條帶的吸光度值(AA),把各組蛋白與其對應(yīng)的內(nèi)參蛋白β-Actin的AA比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有的實驗結(jié)果均取自3次以上的獨立實驗,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,然后采用單因素方差分析將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。其中P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測大蒜素對MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

與對照組相比,MPP+誘導(dǎo)組的PC12細(xì)胞的存活百分率顯著下降(P<0.05),且呈濃度依賴性(圖1A);而通過不同劑量大蒜素(0.01、0.1、1和10 μg/mL)處理后,細(xì)胞相對存活率增加,但劑量為10 μg/mL時,細(xì)胞相對存活率明顯下降(P<0.05)(圖1B),因此實驗組的大蒜素濃度選取為0.01、0.1和1 μg/mL。與模型組相比,4 mM的MPP+與不同濃度的大蒜素(0.01、0.1和1 μg/mL)聯(lián)合培養(yǎng)組的細(xì)胞相對存活率明顯增加(P<0.05),而且呈濃度依賴性(圖1C)。

圖1 不同濃度大蒜素及MPP+對PC12細(xì)胞活力的影響

2.2 大蒜素對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

和對照組比較,MPP+誘導(dǎo)組中ROS的相對熒光強度(RFU)顯著升高(P<0.05);與MPP+誘導(dǎo)組比較,經(jīng)不同劑量大蒜素干預(yù)后,PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平均隨著藥物濃度升高而降低(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

圖2 大蒜素對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

2.3 大蒜素對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA水平的影響

和對照組比較,MPP+誘導(dǎo)組中SOD水平顯著降低(P<0.05);與MPP+誘導(dǎo)組比較,經(jīng)不同劑量大蒜素干預(yù)后,PC12細(xì)胞內(nèi)SOD水平均隨著藥物濃度升高而升高(P<0.05),且呈濃度依賴性(圖3A)。和對照組比較,MPP+誘導(dǎo)組中MDA水平顯著升高(P<0.05);與MPP+誘導(dǎo)組比較,經(jīng)不同劑量大蒜素干預(yù)后,PC12細(xì)胞內(nèi)MDA水平均隨著藥物濃度升高而降低(P<0.05),且呈濃度依賴性(圖3B)。

圖3 大蒜素對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞SOD和MDA水平的影響

2.4 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測

和對照組比較,MPP+誘導(dǎo)組中細(xì)胞凋亡水平顯著升高(P<0.05);與MPP+誘導(dǎo)組比較,經(jīng)不同劑量大蒜素干預(yù)后,PC12細(xì)胞的凋亡水平均隨著藥物濃度升高而降低(P<0.05),且呈濃度依賴性(圖4)。

圖4 大蒜素對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

2.5 Western blot檢測大蒜素對MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Cyt C信號通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Cleaved-caspase 3、Bax表達(dá)的影響

與正常組比較,模型組Bcl-2、Cyt C表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖5B、5E), Bax、Cleaved-caspase 3表達(dá)明顯增高(P<0.05)(圖5C、5D);與模型組比較,不同劑量大蒜素干預(yù)組Bcl-2、Cyt C表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖5B、5E), Bax、Cleaved-caspase 3表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖5C、5D)。

圖5 大蒜素對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

帕金森病是一類神經(jīng)退行性疾病,目前的研究認(rèn)為其和氧化/抗氧化失衡引起的細(xì)胞損傷有關(guān)。本研究通過MPP+處理PC12細(xì)胞建立帕金森病的細(xì)胞模型,并使用大蒜素進(jìn)行干預(yù),通過對細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡水平的影響,探討對帕金森病的保護(hù)作用。

大蒜素,是一種從大蒜中提取的活性化合物,具有抗腫瘤、抗炎癥和抗氧化等作用[18-19],同時也具有神經(jīng)保護(hù)作用。體內(nèi)及體外的研究均證實大蒜素通過Akt/eNOS信號通路發(fā)揮其抗氧化及抗炎作用,對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用[16,20]。另外,大蒜素可以通過增強Nrf2抗氧化信號通路來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞以改善認(rèn)知和記憶缺陷[21],大蒜素也可改善阿爾茨海默病模型的空間記憶障礙,減少神經(jīng)元死亡[22]。又有研究報道大蒜素也可以通過影響線粒體功能來保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[23]。本研究首次通過大蒜素對MPP+誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的影響,研究其對帕金森病的保護(hù)作用。本研究通過檢測不同濃度的大蒜素處理后的PC12細(xì)胞的增殖活性,發(fā)現(xiàn)0.01、0.1和1 μg/mL濃度的大蒜素對PC12細(xì)胞無毒性作用,而10 μg/mL 的大蒜素可顯著降低細(xì)胞的活性。有研究報道[24]1 mM濃度的大蒜素可以顯著降低PC12細(xì)胞的存活能力。本研究結(jié)果與之一致,即大劑量的大蒜素可以對PC12細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。因此最終選取3種濃度相對較低的大蒜素(0.01、0.1和1 μg/mL)進(jìn)行后續(xù)實驗。為建立神經(jīng)毒性模型,本研究通過給予PC12細(xì)胞不同濃度的MPP+處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 mM的MPP+處理PC12細(xì)胞后表現(xiàn)為較為適中的細(xì)胞增殖活性,因此在后續(xù)實驗中選取4 mM的MPP+對PC12細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜素通過劑量依賴的方式減弱了MPP+對PC12細(xì)胞增殖活性的抑制作用,即大蒜素通過提高細(xì)胞增殖活力對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞起保護(hù)作用。

活性氧(ROS)在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起第二信使的作用,在炎癥和氧化損傷中起中介作用。線粒體是產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器,也是ROS的主要靶點。ROS與氧化應(yīng)激相關(guān),參與細(xì)胞凋亡、壞死和自噬等多種生物過程。氧化應(yīng)激可能通過活性氧的產(chǎn)生造成神經(jīng)損傷,引起神經(jīng)退行性疾病。有研究證明,ROS的產(chǎn)生可以導(dǎo)致PC12細(xì)胞的凋亡[25-26],而大蒜素可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗氧化產(chǎn)物,減少細(xì)胞毒性物質(zhì)和清除各種自由基[27],保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。本研究通過對ROS的檢測,發(fā)現(xiàn)大蒜素降低了MPP+誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,與以往的研究相一致,從而說明了大蒜素可以減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而對細(xì)胞起保護(hù)作用。

細(xì)胞膜中的不飽和磷脂易受自由基攻擊,引發(fā)連鎖反應(yīng),導(dǎo)致如丙二醛(MDA)等產(chǎn)物的積累,又通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激對細(xì)胞造成損害。細(xì)胞通常會對氧化應(yīng)激作出反應(yīng),通過酶促反應(yīng)[28]降低氧化應(yīng)激,以提高細(xì)胞的防御能力,防止細(xì)胞損傷。抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)包括抗氧化酶SOD,CAT和GSH-Px等,是對抗過量氧自由基的第一道防線。有研究證實,大蒜素可通過增強抗氧化酶活性和改善線粒體功能,對兔脊髓缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用[29]。也有研究報道大蒜素可通過影響內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)和線粒體功能來保護(hù)6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PD相關(guān)的神經(jīng)元損傷[17]。說明氧化應(yīng)激可造成PD的神經(jīng)損傷,而本研究與之一致,本研究通過對SOD、MDA的檢測發(fā)現(xiàn),大蒜素減少了MPP+所致的PC12細(xì)胞MDA的產(chǎn)生,并提高了抗氧化酶SOD的表達(dá),表明大蒜素可以通過增加內(nèi)源性抗氧化酶的活性來提高細(xì)胞的抗氧化能力,減少氧化產(chǎn)物的生成,從而對MPP+造成的PC12細(xì)胞的氧化損傷起保護(hù)作用。

凋亡是細(xì)胞周期中不可或缺的一部分,是一個程序性細(xì)胞死亡的過程,是機體正常發(fā)育和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞的凋亡受細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控,促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2同屬于Bcl-2家族,Bcl-2與Bax可以改變細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)膜的通透性,進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡激活物細(xì)胞色素C(Cyt C)等的釋放,活化下游Caspase,進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30-31]。研究發(fā)現(xiàn)大蒜素有抑制細(xì)胞凋亡的作用[32-33]。因此為了研究大蒜素對MPP+誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞引起的凋亡情況,本研究使用流式細(xì)胞儀,采用AnnexinV-FITC/PI雙染法對PC12細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),大蒜素可以明顯抑制MPP+對PC12細(xì)胞造成的凋亡。同時使用Western blot對相應(yīng)的凋亡蛋白進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜素逆轉(zhuǎn)了MPP+對PC12細(xì)胞線粒體Cyt C以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3的表達(dá)的影響。這些結(jié)果說明大蒜素可能是通過線粒體途徑增強了細(xì)胞的抗凋亡活性,從而抑制了MPP+所致的PC12細(xì)胞的凋亡。

綜上所述,具有抗炎、抗菌、抗高血壓和抗癌活性等功能的大蒜素[34-35],可以顯著降低MPP+引起的PC12細(xì)胞的損傷,這種對細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過線粒體途徑提高了細(xì)胞的抗凋亡及抗氧化酶活性,從而抑制細(xì)胞的凋亡來完成的。因此作為一種中草藥提取物,大蒜素對PD具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用,有望為臨床PD的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。