氯化兩面針堿對膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響

朱長吉,李紅紅,沈忠軍,玄延花,嚴 莉

(1.延邊大學醫學院,吉林 延邊133000;2.吉林大學第二醫院 檢驗科;3.延邊大學醫學院 病理學教研室;4.長春市中心血站)

膠質瘤(glioma)是成人最常見的原發性顱內腫瘤,約占中樞神經系統腫瘤的70%。盡管近年采取了多項治療措施,包括手術治療、聯合放療和化療及生物治療等,但膠質瘤的預后仍然很差,特別是惡性膠質瘤膠質母細胞瘤(glioblastoma),診斷后的中位生存期僅有14.6個月[1]。惡性膠質瘤具有快速增殖和高度侵襲性的特點、術后復發率高、預后不良。氯化兩面針堿(nitidine chloride,NC)是植物中提取的一種生物堿,主要從蕓香科花椒的根中提取而來。有研究表明,NC在乳腺癌和肝癌等多種癌癥中具有抗癌作用,可能通過誘導細胞凋亡、阻斷細胞周期、阻礙血管生成及抑制腫瘤細胞遷移和侵襲等機制發揮作用[2-5],然而,NC對膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲的作用尚有待闡明。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人腦膠質母細胞瘤LN18細胞(上海通派生物科技公司)。NC(四川恒誠致遠生物公司),DMEM培養基(美國Gibco公司),胎牛血清(以色列Bioind公司),二甲基亞砜(DMSO)、青霉素和鏈霉素(上海聯邁生物公司)、CCK-8試劑盒(上海尚寶生物公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、電泳儀和轉膜儀(北京六一儀器廠)、酶標儀(北京六一儀器廠)、倒置顯微鏡(深圳博視達光學儀器公司)。

1.2 細胞培養和分組LN18細胞采用含10%胎牛血清、青霉素(100U·mL-1)和鏈霉素(100 mg·L-1)的DMEM培養基,在37℃、5%CO2培養箱中培養。每2天更換1次培養基,當細胞達80%～90%融合時取對數生長期細胞用于實驗。細胞分為2組:在細胞培養基中加入NC為處理組,只加入培養基為對照組。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活率及計算IC50選擇NC合適濃度準備好實驗所需試劑,向96孔板里加200 μl培養基,調整細胞密度為每孔8 000個細胞左右,待細胞貼壁后,向細胞培養基中加入不同濃度NC,使96孔板中每孔NC的濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 μM,對照組加入等體積的培養基,置于培養箱中培養。次日取出96孔板,每孔加入CCK-8試劑20 μl,繼續放入培養箱培養0.5 h。用酶標儀在450 nm波長處測定每個孔的吸光度值(A值)。細胞存活率=處理組A值/對照組A值×100%。IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)],重復4次,取平均值。公式中Xm:設計的最大濃度的對數值;i:各濃度倍比濃度的對數值;ΣP:各組生長抑制率之和;0.5:經驗常數。

1.4 劃痕實驗檢測細胞遷移率準備好實驗所需試劑,預先在6孔板背面畫出3條距離相同的水平橫線,調整細胞密度,每孔1.5×105個細胞接種于6孔板中培養24 h。用1 ml的槍尖劃出3條平行線,加入PBS將細胞碎片清洗干凈后換成無血清培養基,用NC處理細胞后每個孔中隨機選出3個視野,拍攝0 h劃痕照片。繼續培養48 h后拍照記錄,計算細胞遷移率。細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.5 Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲率準備好實驗所需試劑,把實驗所需槍尖和離心管放在冰盒中預冷處理,稀釋Matrigel基質膠,每個Transwell小室加60 μl,室溫放置8 h,固化培養基。接種細胞前水化基底膜。取生長良好的細胞,收集后細胞計數,取離心管每管內加200 μl含50 000細胞的無血清培養基,對照組不處理、NC組處理組加不同濃度的NC,混合均勻加入小室內,下室加含血清培養基 800 μl,在培養箱內孵育48 h。PBS清洗小室,加4%多聚甲醛固定,30 min后用0.1%結晶紫染色,再一次PBS清洗晾干。每個樣本隨機選取3個視野,顯微鏡拍照記錄實驗結果。計數視野下的穿膜細胞數。細胞侵襲率=處理組穿膜細胞數/對照組穿膜細胞數×100%。

2 結果

2.1 NC對膠質瘤細胞存活率的影響及NC合適濃度的選擇結果顯示,濃度低于2.5 μM的NC處理LN18細胞24 h對細胞存活率影響不明顯。用濃度高于2.5 μM的NC處理LN18細胞24 h和48 h,不同濃度的NC對降低細胞存活率的影響均比較明顯,隨著NC濃度的增加,細胞存活率逐漸降低,呈濃度依賴性(表1)。在作用時間48 h時IC50濃度在5.0 μM到7.5 μM之間,因此選擇5.0、7.5 μM 兩個濃度的NC進行后續實驗。

表1 NC對膠質瘤LN18細胞存活率的影響

2.2 NC對膠質瘤細胞遷移能力的影響結果顯示,與對照組比較,NC處理后LN18細胞的劃痕距離比對照組明顯增大,細胞遷移率也明顯降低,細胞遷移率隨NC濃度的增加而降低(圖1,表2)。

圖1 NC對膠質瘤LN18細胞劃痕距離的影響(×100)

表2 NC對膠質瘤LN18細胞遷移率的影響

2.3 NC對膠質瘤細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗結果顯示,與對照組比較,NC處理后LN18細胞的穿膜細胞數明顯減少,細胞侵襲率明顯降低,細胞侵襲率隨NC濃度的增加而降低(圖2,表3)。

圖2 NC對膠質瘤細胞穿膜細胞數的影響(×200)

表3 NC對膠質瘤LN18細胞侵襲率的影響

3 討論

本研究采用CCK-8法檢測結果顯示,與對照組比較,LN細胞用不同濃度NC處理24 h和48 h后,細胞存活率呈濃度依賴性降低,說明NC能抑制LN細胞增殖。這可能與NC對腫瘤細胞周期的影響有關。有研究表明,NC能誘導乳腺癌細胞周期停滯[2],NC可誘導神經膠質瘤細胞在G2/M期的細胞周期停滯[6]。

本研究細胞劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗結果顯示,與對照組比較,經不同濃度NC處理后LN18細胞的劃痕距離和細胞遷移率明顯降低,細胞侵襲率也明顯降低,說明NC能抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲,但NC抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲的機制尚不清楚。高度侵襲性生長是膠質瘤的重要特征之一,惡性膠質瘤主要侵入周圍正常腦組織及血管周圍間隙,與正常腦組織的界限不清楚,也難以通過手術完全切除腫瘤,術后常常復發,這是膠質瘤預后不良的主要原因[7]。在侵入周圍腦組織及血管周圍間隙過程中,膠質瘤細胞通常會發生一些行為學變化,包括獲得間質細胞表型、降解細胞外基質(ECM)能力和干細胞表型等。上皮-間質轉化(EMT)是惡性腫瘤細胞獲得間質細胞表型、增加遷移和侵襲能力的重要生物學基礎[8]。近年多項研究證明,腦膠質瘤細胞能夠發生EMT[9-10]。有研究表明,NC能夠抑制乳腺癌細胞的EMT[11];NC可抑制骨肉瘤細胞EMT減少細胞侵襲能力[4]。在Transwell小室侵襲實驗中,將基質膠(Matrigel)鋪在聚碳酸酯膜上制備人工基底膜。當腫瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶(MMPs)等蛋白酶水解類降解基質膠后,細胞移動到膜的下室面,通過計數膜下室面的細胞數,可反映腫瘤細胞在體外的侵襲能力。一項研究表明,NC通過抑制MMP-2和MMP-9活性來減弱腎癌細胞細胞的侵襲力[12],NC通過降低MMP-2和MMP-9活性抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲[3]。

綜上所述,本研究通過體外實驗證實NC能抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲,在膠質瘤治療中具有較好的應用前景。但把NC應用于膠質瘤的臨床治療,還需考慮NC的臟器毒性及通過血腦屏障等問題。