Skp2及p27kip1在原發性胃癌組織的表達及對胃癌細胞增殖、凋亡的影響

張永健,郭學海*,高秀鳳,王 斌,趙宏陽

(1.開灤總醫院林西醫院 普外科,河北 開灤063103;2.開灤總醫院林西醫院 消化內科,河北 開灤063103)

原發性胃癌是起源于胃黏膜的癌癥,是臨床常見的惡性腫瘤,盡管其發病率逐漸下降,胃癌仍然是全世界癌癥相關死亡的最常見原因之一[1]。幽門螺桿菌感染是胃癌的主要危險因素,新分子有助于胃癌的診斷和降低死亡率,大多數被充分研究的分子是由胃上皮表達的組織蛋白生物標記物,與細胞周期調控和細胞凋亡調控相關[2-3]。S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,SKP2)是細胞周期蛋白A-CDK2 S期激酶的基本成分[4],它主要在S期特異性識別磷酸化細胞周期素依賴的蛋白激酶抑制物(Cyclin dependent protein kinase inhibitor,p27kip1)[5],并參與了多種癌癥的發生發展和細胞凋亡調控,是腫瘤治療的新靶點[6-7]。研究表明Skp2和Slug在侵襲性前列腺癌中共表達,并受到去甲酰化阻滯的抑制,在前列腺癌細胞的凋亡中發揮調控作用[8],Skp2蛋白在宮頸癌組織中的表達率高于癌旁組織,其表達與臨床分期、惡性程度、淋巴結轉移、血管浸潤和間質浸潤呈正相關[9],也有研究通過小鼠實驗證實SKP2和p27Kip1可以通過靶向MEK/ERK途徑增強CDK4/6抑制劑的細胞抑制作用[10],但Skp2和p27Kip1在原發性胃癌中的表達和對胃癌細胞增殖凋亡的作用尚不清晰,因此本研究入組臨床原發性胃癌患者,分析癌組織和癌旁組織中Skp2和p27Kip1的表達水平,并通過細胞學實驗探究Skp2和p27Kip1對胃癌細胞增殖、存活、早期凋亡和晚期凋亡的作用,為Skp2和p27Kip1在原發性胃癌中發揮的作用提供分子機制和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2018年12月至2021年12月開灤總醫院林西醫院資料完整并經臨床、病理證實的原發性胃癌患者63例,獲取患者癌組織和癌旁組織。本實驗中所有患者均簽署知情同意書并通過開灤總醫院林西醫院倫理委員會審核。

人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑及儀器

RPMI-1640培養基,胎牛血清FBS和青鏈霉素購于購于美國Gibico公司;T25細胞培養瓶、離心管等實驗耗材購于美國Corning公司;NC質粒和si-Skp2質粒購于廣州Ribobio公司;Skp2和p27Kip1引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。lipofectamine3000(貨號: L3000015)購于美國invitrigen 公司,Cell Counting Kit-8(CCK8,貨號Cat.No.:HY-K0301)細胞增殖及毒性檢測試劑盒購于美國MCE公司;細胞凋亡試劑盒7-ADD/Annexin V(貨號:KGA)購于南京凱基生物公司,qPCR儀購于美國ABI公司,FACSVia流式細胞儀購于美國BD公司,PTC-3500全波長酶標儀購于北京普天新橋技術有限,Western blot電泳儀購于美國bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1qPCR檢測胃癌組織和胃癌旁組織中Skp2和p27Kip1mRNA表達

對癌組織和癌旁組織在液氮中進行研磨,采用Trizol、Titan One Tube RT-PCR和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR試劑盒進行總mRNA提取、逆轉錄并進行Skp2和p27Kip1的表達水平的qPCR,所有操作避免RNA酶污染。使用ABI 7500系統進行實時熒光定量PCR,預變性95 ℃ 10 min,變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃25 s,延伸72 ℃ 205 s,38個循環, Skp2、p27Kip1和GAPDH引物序列見表1,使用GAPDH作為內參,以2-△△Ct計算Skp2和p27Kip1相對表達量。

表1 qPCR檢測中不同基因的引物序列

1.3.2細胞培養及轉染條件

SGC-7901培養條件:RPIM1640培養液(內含10%胎牛血清、青霉素100 μg/ml、鏈霉素100 μg/ml),置CO2培養箱內,5%CO2,37℃靜置培養;細胞轉染:用胰酶消化細胞后重選,嚴格按照轉染試劑盒lipo3000說明將NC和Skp2質粒進行轉染,轉染6～8 h后更換成完全培養基重新加入完全培養基,置于5%CO2培養箱中37℃培養,48 h后用于各組實驗。

1.3.3CCK8法檢測人胃癌細胞SGC-7901細胞活力

以CCK-8測定細胞活力,嚴格按照CCK8試劑盒說明進行操作,將細胞轉染質粒后以2×103的密度接種到96孔板中,分別在37℃下培養24 h、48 h和72 h,向每孔加入10 μl CCK-8 溶液(此過程避免孔中生成氣泡以避免影響OD值的讀數),將培養板在培養箱內孵育1～4 h,用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。

1.3.4細胞凋亡實驗

將生長對數期的SGC-7901細胞胰酶消化后收集全部細胞,PBS緩沖液重懸細胞,嚴格按照細胞凋亡7-ADD/annexin V試劑盒進行凋亡實驗,避光孵育20 min,PBS清洗1遍,200 μl PBS重懸細胞,流式細胞儀進行細胞凋亡分析,所有操作均在冰上避光完成,各組實驗重復3次。

1.3.5Western blot 檢測蛋白表達

將各組狀態良好的SGC-7901細胞1 ml RIPA蛋白裂解液冰上提取細胞總蛋白,使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后備用。將樣品分別加入不同的泳道進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,濃縮膠電壓和分離膠電壓分別為80V 10 min,120V 1.5 h,后轉至PVDF膜,用5%BSA封閉。加入特異性一抗Anti-SKP2 antibody(1∶200,ab183039,abcam,英國),Anti-p27 KIP 1 antibody(1∶5 000,ab32034,abcam,英國)和GAPDH(1∶10 000,ab8245,abcam,英國)于4℃冰箱過夜。TBST洗膜3次,每次10 min,加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000),孵育1 h。TBST洗膜3次,每次10 min,采用ECL化學發光液曝光顯影,使用Photoshop圖像分析軟件系統進行半定量分析。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

本研究共入組胃癌患者63例,平均年齡57.45±6.31歲,患者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),臨床一般資料詳見表2。

表2 63例患者一般臨床資料的比較

2.2 Skp2和p27Kip1在癌組織和癌旁組織中mRNA的表達比較

通過qPCR法檢測癌組織和癌旁組織Skp2和p27Kip1mRNA表達水平,結果如圖1所示,與癌旁組織相比,癌組織中Skp2mRNA表達水平顯著升高,p27Kip1mRNA表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 Skp2和p27Kip1在胃癌組織和癌旁組織中mRNA的表達比較

2.3 si-Skp2對人胃癌細胞SGC-7901細胞活力的影響

通過CCK8實驗分析si-Skp2對人胃癌細胞SGC-7901活力的影響,結果表明與對照組相比,si-Skp2組胃癌細胞SGC-7901細胞活力出現顯著下降,具體表現為24 h、48 h、72 h的吸光度分別顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.01),見表3。

表3 Skp2和p27Kip1對人胃癌細胞SGC-7901細胞活力的影響

2.4 si-Skp2對人胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響

通過流式細胞實驗分析si-Skp2對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響,如圖2,結果表明與對照組相比,si-Skp2組細胞存活顯著降低、細胞晚期凋亡顯著增加,差異有統計學意義(P<0.01),而細胞早期凋亡沒有統計學意義(P>0.05)。

圖2 Skp2和p27Kip1對人胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響

2.5 si-Skp2對p27Kip1蛋白表達的影響

如圖3通過Western blot 檢測各組細胞Skp2和p27Kip1蛋白變化,結果表明與對照組相比,si-Skp2組Skp2蛋白表達水平顯著降低,p27Kip1蛋白表達水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)。

圖3 si-Skp2對p27Kip1蛋白表達的影響

3 討論

原發性胃癌一般起源于胃黏膜細胞,由于飲食結構的改變、工作壓力增大以及幽門螺桿菌的感染等原因,胃癌呈現年輕化傾向[11]。胃癌可發生于胃的任何部位,其中半數以上發生于胃竇部,胃大彎、胃小彎及前后壁均可受累。絕大多數胃癌屬于腺癌,早期無明顯癥狀,最主要的癥狀即為腹痛,其預后不良并伴有轉移,是導致癌癥死亡的主要原因[12]。不同患者的腫瘤特征不同,不同的患者存在不同的腫瘤微環境[13]。有研究證實原發性胃癌中伴隨著多種基因的調控,通過對臨床全基因組RNA-seq數據分析證實原發性胃癌患者腫瘤內具有異質性,多種細胞周期調控和細胞凋亡調控基因如Skp2、ERBB2、CLDN11和CDK12發揮重要作用[14]。有研究根據Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風險回歸分析證實胃癌患者中細胞的增殖、細胞周期G1/S轉換與患者的不良預后相關[15]。Skp2是一種能與S期激酶cyclinA-CDKI相互作用的蛋白,Skp2的表達水平在G0/G1 期降低,在S期表達增加[16]。Skp2的表達受轉錄及轉錄后水平雙重調節,與在不同類型的細胞中起主導作用的調節機制不同,Skp2能特異性識別磷酸化底物并介導其泛素化降解,調節p27Kip1等細胞周期調控因子[17]。本研究通過qPCR證實在不同病理分期、不同轉移程度、不同年齡的患者中,均出現了顯著的Skp2 高表達,而p27Kip1顯著低表達的現象,這提示出Skp2 和 p27Kip1在胃癌進展中可能發揮重要作用,并且在不同類型的胃癌患者中具有普遍性,有望成為的胃癌早期診斷分子標志物。

細胞增殖和細胞凋亡是生命的基本現象,可以維持體內細胞數量動態平衡。在胚胎的發育、機體衰老和病變的細胞中發揮調控作用,保證了機體的健康。細胞增殖和細胞凋亡受多種基因調控[18-19],細胞的異常增殖和凋亡失控會引發癌癥等疾病,研究表明Skp2在許多人類癌癥中也過度表達,Skp2可以靶向磷酸化p27進行蛋白酶體降解,對多種細胞生長、凋亡發揮直接調控作用,因此Skp2被認為是癌基因和重要的藥物靶點[20]。本研究通過細胞學實驗證實敲除Skp2后,胃癌細胞的增殖能力顯著降低,細胞存活顯著降低,細胞晚期凋亡比例顯著增加,Western blot 結果證實敲除Skp2后,胃癌細胞的P27Kip表達顯著上升,由此可見skp2可通過p21Kip1對胃癌細胞的增殖和凋亡發揮調控作用。

綜上,本研究證實在原發性胃癌患者中Skp2高表達、p21Kip1低表達,有望作為早期診斷的生物標志物,并且Skp2可以通過p27Kip1抑制人胃癌細胞活性,降低細胞的增殖能力,誘導胃癌細胞晚期凋亡。本研究可以進一步擴大臨床樣本量,通過ROC曲線等分析,Skp2和p27Kip1可以作為早期診斷或者預測胃癌患者的生物學標志物,為臨床診斷和治療提供新思路。