白細胞介素-1β 通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進腦膠質瘤細胞的侵襲

王 棒,吳 娟,陳碩碩,程 哲,束漢生

(蚌埠醫學院第二附屬醫院 神經外科,安徽 蚌埠233000)

腦膠質瘤是起源于腦神經膠質細胞的腫瘤,是最常見的原發性顱內腫瘤。我國腦膠質瘤約一半為惡性程度最高的膠質母細胞瘤(GBM)。高級別膠質瘤由于增殖率高、腫瘤細胞高度異質性和彌漫浸潤等特點,盡管目前采用了以手術為主,結合放化療、免疫治療、電場治療等綜合治療手段,但治療效果仍不理想,其中膠質母細胞瘤患者的中位生存期僅為14.4月,5年生存率約為5.5%[1-3]。目前已經有大量的研究揭示了膠質瘤可能的發病機制[4-5],但其確切發病機制仍不明確,因此,需要尋找膠質瘤治療的新靶點。

腫瘤微環境中白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)的增加會導致腫瘤的顯著進展[6]。有研究指出,膠質瘤微環境中含有的大量的免疫細胞、血管內皮細胞和腫瘤干細胞等,可分泌大量的炎癥因子,比如細胞因子IL-1β、IL-6、白細胞介素23(IL-23)和腫瘤壞死因子(TNF)等。這些炎癥因子可調控膠質瘤細胞的生長、侵襲等,甚至使膠質瘤抵抗放化療[7-8]。IL-1β是一種強有力的促炎細胞因子,產生IL-1β的腫瘤患者一般預后較差[9]。有研究指出其在體內外均可促進膠質瘤細胞的增殖[10]。IL-6亦是一種關鍵的促炎細胞因子,可以直接刺激腫瘤細胞的增殖、轉移、侵襲及血管生成等,其在慢性炎癥、大量的造血系統惡性腫瘤以及實體腫瘤患者中水平均有所升高[11-12]。

之前有研究指出IL-1β可以刺激神經膠質瘤細胞中核因子κB(NF-κB)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、細胞外信號調節激酶 1/2(ERK1/2),以及信號轉導和轉錄激活因子(STAT3)等因子的激活[13]。與此同時,IL-6/JAK2/STAT3信號通路已被證實在多種人類癌癥的生長和發展中起著關鍵作用[14]。因此,IL-1β能否通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進腦膠質瘤細胞的惡性進展有待研究。

膠質瘤細胞極強的侵襲特性,是導致全切率低、術后復發及預后差的主要原因[15]。在本研究將運用多種分子生物學手段觀察不同濃度的IL-1β對人腦膠質瘤細胞侵襲的影響,同時檢測IL-6的生成及JAK2、STAT3等信號分子的表達情況。重點解析在膠質瘤細胞侵襲過程中IL-1β與IL-6的關系及其下游信號通路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

重組人IL-1β蛋白、IL-6蛋白購自蘇州novoprotein科技有限公司;重組人IL-6中和蛋白、酶標山羊抗兔IgG單克隆抗體、Lipofectamin2000購自美國Thermo Fisher Scientific;兔抗人抗體總JAK2(t-JAK2)、Phospho-JAK2-Tyr 221(p-JAK2)、總STAT3(t-STAT3)、Phospho-STAT3-Tyr705(p-STAT3)購自武漢Abclonal生物科技有限公司;Jak2 siRNA(si Jak2)、STAT3 siRNA(siSTAT3)和對照siRNA(siNC)購自上海吉瑪科技有限公司;IL-1β、IL-6ELISA檢測試劑盒購自深圳達科為公司;CCK-8試劑盒購自合肥BIOMIKY生物科技有限公司;人腦膠質瘤細胞株U87購自武漢賽諾普科技公司,U251、A172、正常人腦星形膠質細胞株NHA由蘇州大學第二附屬醫院惠贈;細胞基礎培養基DMEM、減血清培養基Opti-MEM、胎牛血清FBS和胰蛋白酶均購自美國 Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養

人腦膠質瘤細胞 U87、U251、A172和人星形膠質細胞 NHA均在含 10%胎牛血清的 DMEM完全培養基,溫度為 37℃、CO2濕度為5%的細胞恒溫培養箱中培養,當細胞生長到70%～80%左右時進行傳代處理。

1.2.2細胞藥物處理和分組

選擇高表達IL-1β與IL-6的膠質瘤細胞為實驗細胞,第一階段用不同濃度的重組人IL-1β蛋白刺激膠質瘤細胞的濃度分組為0、0.2 ng/ml、2 ng/ml、20 ng/ml、200 ng/ml,孵育時間24 h。后期驗證IL-1β與IL-6生成的關系分組為對照組(Ctrl)、IL-1β組(IL-1β)、IL-1β+IL-6組(IL-1β+IL-6)、IL-1β+IL-6中和蛋白組(IL-1β+Anti-IL-6),藥物濃度分別為IL-1β 20 ng/ml,IL-6 100 ng/ml,IL-6中和蛋白1000 ng/ml,孵育時間24 h。

1.2.3細胞轉染和分組

根據是否轉染及轉染 si-RNA的種類將每種細胞分成4組:空白對照組(IL-1β組,不轉染,僅予以IL-1β刺激)、陰性對照組(IL-1β+siNC組,轉染無意義的siNC序列),實驗組1(IL-1β+siJAK2組,轉染有意義的陽性siJAK2序列),實驗組2(IL-1β+siSTAT3組,轉染有意義的陽性siSTAT3序列)。A液:把5 μL siRNA加入到 250 μL的 opti-MEM減血清培養基中并搖晃混勻;B液:在 250 μL的 opti-MEM減血清培養基中加入5 μL Lipofectamine2000并輕輕混勻,室溫靜置 5 min;將A、B液混勻后室溫靜置18 min后將混合液分別滴加到各組,輕輕搖勻6孔板后置于恒溫孵育箱中溫育6 h,更換新鮮完全培養基,細胞繼續培養 24 h后用于后續實驗。

1.2.4ELISA測IL-1β與IL-6濃度

細胞(500 000/孔)接種于6孔板,2 ml完全培養基中培養。培養24 h后,用藥物刺激細胞。給藥后1天,每孔共加入100 μL樣品,每個試驗孔做3個復孔。加稀釋后的Biotinylated antibody,蓋上封板膜,孵育一定時間,洗板3次。加入稀釋后的Streptavidin-HRP,洗板3次。加入TMB孵育20～30 min顯色,顯色深藍色后加入Stop solution終止反應。終止反應10 min內酶標儀于波長450 nm處讀板。

1.2.5Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力

取稀釋后的生物基質膠 50 μL/孔勻稱地鋪于Transwell小室底層,放入培養箱孵育1 h待膠凝固。按組別分別取對數生長期的細胞,消化離心后用無血清不完全培養基進行重懸計數。5萬細胞/孔加入無血清不完全培養基。培養1天后,細胞予以藥物刺激或轉染siRNA。24 h后取出小室,先用4%多聚甲醛固定15 min,再用結晶紫染液染色15 min,在 PBS中漂去多余染料,小心擦凈小室上層內細胞,在倒置顯微鏡下拍照觀察細胞形態和均勻度并計數。

1.2.6Western blot實驗檢測蛋白表達水平

收集細胞,使用RIPA裂解細胞,BCA法總蛋白定量。配制6%分離膠和5%濃縮膠,每孔加入等質量等體積目的蛋白(50 μg/10 μl),電壓80 V時間30 min上層濃縮膠、電壓120 V時間50 min下層分離膠電泳。轉膜、洗膜、封閉,采用抗GAPDH、t-Jak2、p-JAK2、t-STAT3、p-STAT3一抗及山羊抗兔IgG二抗檢測相應蛋白的表達。采用Image J軟件分析條帶的光密度值,每個條帶重復3次,計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 IL-1β、IL-6在膠質瘤細胞培養液中的表達情況及IL-1β刺激下IL-6的生成情況

ELISA結果顯示,與NHA相比,U87、U251的培養液中IL-1β水平明顯升高;與NHA相比,U87、U251、A172的培養液中IL-6水平均明顯升高(圖1A、B)。這表明某些膠質瘤細胞具有在體外自發分泌IL-1β和IL-6的能力。因此,選擇表達水平高的U87、U251細胞進行后續實驗。

圖1 IL-1β、IL-6在人腦膠質瘤細胞培養液中的表達情況及IL-1β刺激下IL-6的生成情況

在U87、U251細胞中,IL-1β可以以劑量依賴性的方式促進IL-6的生成(圖1C、D)。

2.2 IL-1β促進腦膠質瘤細胞的侵襲

Transwell小室侵襲實驗表明,IL-1β可以以劑量依賴性的方式增強U87和U251細胞的侵襲能力(圖2)。

圖2 不同濃度的IL-1β刺激下膠質瘤細胞侵襲能力的變化情況

2.3 IL-1β通過IL-6促進腦膠質瘤細胞的侵襲

Transwell小室實驗表明,IL-6可以在IL-1β促進膠質瘤細胞侵襲的情況下進一步促進細胞侵襲,而IL-6中和蛋白可以顯著地抑制IL-1β的促侵襲作用(圖3)。這表明IL-1β是通過刺激IL-6的分泌來促進人腦膠質瘤細胞的侵襲的。

圖3 改變IL-6含量后U87、U251細胞侵襲能力的變化情況

2.4 IL-1β通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進腦膠質瘤細胞的侵襲

Western印跡實驗結果表明,IL-1β可以促進JAK2和STAT3磷酸化蛋白的表達,IL-6可以進一步促進它們的表達,而IL-6中和蛋白則顯著下調其表達水平。siJAK2可以下調JAK2和STAT3磷酸化蛋白的表達水平,而siSTAT3則不能下調JAK2磷酸化蛋白的表達水平,這驗證了JAK2和STAT3之間的上下游關系(圖4)。這表明IL-1β通過刺激IL-6的生成來促進JAK2/STAT3通路磷酸化蛋白的表達。

圖4 不同條件下膠質瘤細胞內JAK2、STAT3磷酸化蛋白表達水平的變化

同時Transwell小室實驗結果表明,下調JAK2、STAT3基因表達水平可以顯著地地抑制IL-1β的促侵襲作用(圖5)。這表明JAK2/STAT3通路是IL-1β促進人腦膠質瘤細胞侵襲所必需的。以上數據清楚地說明IL-1β是通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進腦膠質瘤細胞的侵襲的。

圖5 下調JAK2、STAT3表達水平后U87、U251細胞侵襲能力的變化情況

3 討論

腦膠質瘤是一種致命性的腦腫瘤,近年來,關于腦膠質瘤的基礎及臨床研究有了一定進展,但病人的預后卻沒有因此明顯改善[16-17]。分子標記、IDH突變、MGMT啟動子甲基化、1p/19q共缺失、PTEN突變、EGFR擴增等,在調節腫瘤細胞增殖和侵襲等方面發揮著核心作用,且已經用于膠質瘤患者的分子病理學診斷、治療選擇和預后評估,針對這些分子標志物的許多神經膠質瘤療法已被用于臨床實驗,但最終成功的寥寥無幾[18],因此需要尋找新的治療靶點。

針對膠質瘤微環境的研究是一種全新的思路。膠質瘤微環境中含有的大量的免疫細胞、血管內皮細胞和腫瘤干細胞等,可分泌大量的炎癥因子和外泌體等,它們可以單獨或協同調控腫瘤的生長[19]。IL-1β是一種多效性的細胞因子,是啟動免疫反應的關鍵因子,同時它也是腫瘤微環境中的中心介質[20]。有研究指出,IL-1β對于惡性細胞的發生發展是必不可少的,惡性腫瘤細胞的進展與其分泌的IL-1β量密切相關[21-22]。IL-1β可由腫瘤間質中的細胞分泌,也可由惡性腫瘤細胞分泌。各種星形膠質細胞、惡性膠質瘤細胞均有在體內外自發產生皮克級的IL-1β的能力[23]。本研究證實,在細胞培養液上清中,NHA及膠質瘤細胞均能產生微量的IL-1β,且U87、U251細胞分泌的量較NHA明顯增加,而A172細胞則變化不明顯,這可能與不同膠質瘤細胞的惡性程度、基因突變不同有關。

IL-1 β幾乎影響腫瘤進展的每一步[24],白細胞介素-1β在IL-1 β惡性膠質瘤中是一種腫瘤促進劑[25]。本研究證實, IL-1β可以以劑量依賴性的方式促進膠質瘤細胞的侵襲。

IL-1β除了在腫瘤發生發展中的直接作用外,它還通過上調其他促炎細胞因子,包括環氧化酶2(COX-2)、IL-6、IL-8等其他細胞因子等,以及增加血管生成來推動腫瘤的生長和進展[26]。其中IL-6已被證實是許多慢性炎癥性疾病的強力驅動,同時它在許多癌癥的發展中起著關鍵的作用[27]。本研究證實,在細胞培養液上清中,NHA及膠質瘤細胞均能產生微量的IL-6,且膠質瘤細胞分泌的量均較NHA明顯增加。同時,IL-1β可以以劑量依賴性的方式促進IL-6的生成。在給予IL-1β刺激的基礎上,發現IL-6可以進一步刺激膠質瘤細胞的侵襲,而IL-6中和蛋白則明顯抑制了IL-1β的促侵襲作用。這表明IL-1β是通過刺激IL-6的分泌來促進膠質瘤侵襲作用的。

IL-1β介導的IL-6/STAT3和NF-κB這兩個關鍵炎癥信號通路的正反饋環被廣泛認為是炎癥和癌癥之間的聯系[28]。JAK2/STA3T信號是近年來發現的一條與細胞因子密切相關的細胞內信號轉導通路,參與了細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生物學過程[29]。本研究發現,IL-1β可以促進JAK2、STAT3的磷酸化蛋白的表達,IL-6可以進一步促進它們的表達。進一步,通過小室實驗發現敲低了JAK2、STAT3表達水平可以顯著抑制膠質瘤細胞的侵襲能力。這說明在IL-1β/IL-6刺激膠質瘤細胞侵襲的過程中,JAK2、STAT3的激活是必需的。與此同時,敲低JAK2明顯抑制了JAK2和STAT3蛋白的磷酸化,而敲低STAT3則對STAT3蛋白的磷酸化沒有影響,這驗證了JAK2和STAT3信號的上下游關系。以上數據表明,IL-1β是通過IL-6/JAK2/STAT3軸來促進膠質瘤細胞的侵襲的。

綜上所述,本研究驗證了IL-1β在體外腦膠質瘤細胞侵襲中的作用,并發現IL-1β是通過刺激IL-6的分泌來促進腦膠質瘤細胞侵襲的。同時,在暴露于IL-1β/IL-6的腦膠質瘤細胞侵襲過程中, JAK2/STAT3磷酸化蛋白的激活是必需的。總之,IL-1β通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進腦膠質瘤細胞的侵襲作用。