YAP蛋白在神經肌肉接頭中作用機制的研究

楊濱瑞,趙琳琳,汪煜楠,初婷婷,鄭永慧,張驚宇

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院 神經內科,黑龍江 哈爾濱150001)

YAP(yes-associated protein,yes相關蛋白)是一種轉錄共激活因子,其本質為富脯氨酸磷蛋白,基因定位于人類染色體11q22區,是調節細胞生長發育通路的關鍵轉錄蛋白。近年相關文獻表明YAP及其通路與多種疾病的發展密切相關。Xu等研究發現在阿爾茨海默病小鼠模型中YAP呈低表達并引起星形膠質細胞的早衰,而上述癥狀可被過度表達的CDK6部分改善[1]。以肌萎縮側索硬化為模型,在探究導致該模型中神經元減少的原因時發現,YAP水平隨著肌萎縮側索硬化疾病進展而逐漸遞減[2]。Watt等發現YAP與TEAD轉錄因子相互作用從而對骨骼肌質量產生促進作用[3]。YAP含量在運動神經損傷后提高并有利于神經源性肌肉萎縮的恢復。因此,激活YAP使肌肉體積縮小癥狀得以改善,以此為基礎為治療神經肌肉疾病提供了新的方向[3]。Gong等發現YAP在腦損傷的過程中對神經細胞具有保護作用,尤其在機體腦缺血損傷后的血腦屏障異常部分中尤為突出[4]。Ma等研究Hippo/YAP受ACTL6A調控并參與非小細胞肺癌的致病過程[5]。Zhu等發現miR-582-5p通過調控YAP/TAZ對非小細胞肺癌的進展產生影響[6]。Mia等探究心臟功能和結構在YAP低表達時得以正常維系[7]。Wang等探究彌漫大B細胞淋巴瘤與糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)的關系,發現GPNMB參與彌漫大B細胞淋巴瘤的發生機制是以YAP1為靶點對Wnt/β-catenin信號通路進行調控[8]。Lundin等通過有關實驗發現造血干細胞的表達需要YAP的參與[9]。Ai等發現YAP通過調節白血病抑制因子進而影響星形膠質細胞的成熟[10]。Salloum等在探究肝纖維化進程中游離脂肪酸與YAP的關系時發現肝纖維化的程度因脂肪酸激活YAP而加重,p38 MAPK參與此過程的調控[11]。Ou等研究發現ROCK1拮抗劑改善腸道纖維化的機制與YAP/TAZ的靶向抑制有關[12]。Ortillon等發現通過拮抗YAP的表達將有利于改善高糖對血管的不利影響[13]。心肌在高血糖時損傷且該過程受腎素受體調控,途徑為腎素受體-AMPK-YAP[14]。目前,YAP與神經-肌肉接頭疾病的聯系研究相對較少。

神經-肌肉接頭疾病是指神經-肌肉接頭間傳遞功能障礙所引起的疾病,主要包括重癥肌無力和Lambert-Eaton肌無力綜合征等[15-17]。既往研究表明agrin作為一種聚集蛋白,可以調控突觸后膜的乙酰膽堿。Chakraborty等研究agrin調控YAP表達關系時發現,agrin通過整合素聚焦黏附和Lrp4/MuSK受體介導的信號通路轉導基質和細胞剛性信號,從而增強YAP的穩定性和機械活性,同時agrin通過YAP依賴的轉錄可以誘導或增加腫瘤發生概率,證明agrin在細胞外基質具有調節YAP表達的作用[18]。本研究通過在分化后的C2C12肌管中用AAV8表達shRNA敲低YAP,發現AChR聚集受到抑制,說明YAP可以獨立于肌管形成而調節NMJ形成。同時在實驗中還發現agrin信號通路可以減弱YAP磷酸化,促進YAP進入細胞核從而發揮轉錄功能,提供了更深入的機制研究,為相關疾病治療提供分子層面的指導意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料C2C12細胞,HEK293細胞,pAV-U6-GFP,Helper質粒,pll3.1質粒,agrin。

1.2 C2C12細胞培養選擇含量為20%、1%的幼牛澳洲血清和胚胎雞萃取物作為培養基DMEM的基質原料,當細胞增殖融合程度為80%時,將培養基質更換為馬血清(4%)的進行細胞引誘分化,時間為4天整,并每24 h觀察1次。

1.3 AAV8包裝純化將編碼scramble shRNA的質粒與Rep/Cap和Helper質粒一起轉染HEK293細胞獲得AAV8。細胞轉染后3天匯集裂解液與培養基。經5次凍融循環和Benzonase處理后,培養基和裂解液組分混合物在4℃以轉速68 000 rpm進行碘克沙醇梯度離心2 h。Amicon 15-100000 MWCO過濾器對40%梯度進行提取濃縮,并通過qPCR進行定量。

1.4 C2C12細胞免疫熒光染色對細胞固定時應添加4%的多聚甲醛(PFA)過夜。PBS溶液沖刷樣本0.5 h。25℃環境中,配比(5%BSA,2%TritonX-100,5%山羊血清PBS)浸泡細胞120 min,后12 h另加一抗與封閉緩沖液(環境溫度為4℃),再選用TritonX-100的PBS液(濃度2%),沖洗樣本60 min,次數為3次。在熒光二抗的參與下進行時長為60 min的室溫孵育,之后進行3次PBS沖洗,每次1 h且該過程使用的PBS應含有2%TritonX-100。再染試劑選用DAPI。用防熒光淬滅封片劑安裝樣品,并用蓋玻片覆蓋。用蔡司共聚焦激光掃描顯微鏡收集Z系列圖像,并折疊成單張圖像。

1.5 Western blot和免疫共沉淀細胞裂解獲得裂解產物。通過SDS-PAGE電泳凝膠后,硝酸纖維素膜承載其分解產物。選用含有5%脫脂牛奶PBS封閉液處理樣本60 min,環境溫度4℃,同時加入一抗,培育12 h。之后進行次數為3次的洗滌,該過程所需的試劑為PBS且其含有0.1% Tween 20。再與室溫25℃的環境下,用酶標二抗培育樣本1 h,反復3次洗滌,再用印跡蛋白ECL成像系統,成像曝光。免疫沉淀試驗用上述裂解緩沖液在無SDS的情況下裂解細胞,用1～2 μg抗體孵育過夜。然后樣品與10 μl蛋白A/G在4℃下孵育5 h,將相關蛋白分解進行Western blot。

1.6 質粒構建和細胞轉染在下面網站中輸入鼠YAP核酸編碼序列設計shRNA:https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do,Target Design Options,將shRNA序列包含莖環和BamHI,HindIII酶切位點5’-GATCC GGAAG CGCTG AGTTC CGAAA TTGTG CTTAT TTCGG AACTC AGCGC TTCCT TTTTA-3’克隆至pAV-U6-GFP載體上。表達鼠YAP蛋白質粒則是以pll3.1質粒為模板,將C端帶有Flag標簽的鼠YAP蛋白的基因編碼序列克隆至CMV啟動子后。質粒-細胞轉染時通過根據相關理論調研,選擇HEK293細胞進行前期培養,當細胞生長至50%～60%程度時,將質粒(5 μg)與PEI(1 mg/ml)(10 μl)共同混合搖勻,同時將DMEM培養基(200 μl)加入,培養細胞15 min,將以上的混勻物加入皿(35 cm)的HEK293細胞,進行12 h的培養,培養后再更換培養基。

1.7 統計學分析選用SPSS25.0,進行數據統計學分析,組間顯著性差異分析選非配對t檢驗和單因素方差分析。P<0.05時,為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 YAP敲低shRNA的構建

與scramble shRNA組相比,YAP水平在shYAP組中明顯下降78%,證實YAP shRNA敲低效率的同時說明其構建成功(圖1)。

圖1 YAPshRNA構建的成果

2.2 肌管形成后敲低YAP抑制乙酰膽堿受體(AChR)聚集

在YAP敲低后AChR的長度和熒光強度都下降了約50%,肌管形成已經完成后YAP功能的缺失會妨礙AChR的聚集,抑制神經肌肉接頭的形成(圖2)。

圖2 肌管形成后YAP敲低的AChR聚集受損

2.3 agrin促進C2C12肌管中的YAP進入細胞核

免疫熒光染色發現agrin加入1 h后就有較多的YAP進入細胞核并于3 h后達到最高,即75.4%的細胞核中有YAP,而且YAP進入細胞核要早于AChR的聚集(圖3)。

圖3 Agrin處理增強C2C12肌管中YAP核定位

2.4 agrin減弱YAP蛋白S127位的磷酸化

agrin處理后YAP磷酸化水平下降直至12 h,YAP-β-catenin結合升高之后下降,說明YAP對于突觸前后的調節有不同的機制(圖4)。

圖4 通過agrin處理降低YAP磷酸化

3 討論

本實驗研究發現agrin通過減弱YAP蛋白磷酸化使YAP進入細胞核發生轉錄進而導致乙酰膽堿受體聚集從而有利于神經肌肉接頭間信號的傳遞。神經-肌肉接頭間生理信息傳導障礙會導致神經-肌肉接頭疾病。目前已有研究者將谷氨酸能神經-肌肉接頭(果蠅)認作一種經典實驗模型用來對突觸相關活動的機制進行研究。部分學者認為氨基酸轉運體JhI-21及c-AMP對谷氨酸受體具有調控作用。前期文獻研究提供了一種假設即某一蛋白或許具有這樣的作用,通過聚集或抑制突觸受體進而影響神經-肌肉接頭的形成。當興奮傳遞至突觸前膜時,ACh在Ca2+的輔助下,通過間隙到達突觸后膜并與其上的受體結合完成信號傳遞。基于上述,實驗中通過對YAP敲低后AChR的長度和熒光強度進行檢測,顯示出敲低YAP可以引起乙酰膽堿受體聚集減少,后續可以繼續探究與神經-肌肉接頭形成相關的其他物質,進一步在其他層面進行多方面驗證。

通過近十年對NMJ的相關實驗研究,已形成蒼蠅和隱桿秀麗線蟲中NMJ的形成與Wnt信號具有關聯性的共識。NMJ在哺乳動物中的形成是否具有相同調節方式,對此尚無明確結論,部分學者提出Wnt通路成員與AChR的表達存在某種程度的相關性這一觀點,Wnt4和Wnt11的表達可以增加AChR的集中和運動神經細胞的增殖從而促進哺乳動物神經肌肉接頭的活性[19]。Wnt3a通過下調AChR聚集和穩定所必需的Rapsyn蛋白進而拮抗AChR的聚集[20]。以上研究證明哺乳動物NMJ的形成過程有Wnt信號參與,但其具體的作用機制仍不明確。Hippo信號通路和Wnt信號通路存在重合點。Wnt通路受到Hippo通路影響的原因是后者導致自由細胞質β-catenin低表達,在此情況下出現細胞周期停滯[21]。綜上所述,Wnt信號通路與Hippo信號通路存在交叉并參與NMJ的形成過程,因此推斷激動Hippo通路基因轉錄翻譯能力的YAP對NMJ的形成可能具有一定的調節作用。以上推理論斷均與本實驗中YAP的作用存在一致性。接下來可以進行相關的細胞和動物實驗,進一步驗證本實驗的結果。

NMJ目前已成為經典的神經-化學突觸模型,近幾年來,對NMJ的構成及其作用原理等進行的研究已經逐漸深入。本實驗從YAP是否可以獨立對NMJ進行調控角度出發,利用細胞免疫熒光染色,Western blot等方法,對NMJ調控機制進行研究,在研究過程中發現agrin信號通路可以減弱YAP磷酸化,促進YAP進入細胞核進而對突觸后 AChR 進行表達調控。目前對于 YAP 影響NMJ形成機制的研究仍處于萌芽階段。未來需要進行更多的相關研究,提供更多的有效數據。