葉酸修飾蟾毒靈陽離子脂質體的制備及體外評價

駱慧婷　歐陽威　王旭易　顏紅　陳姿延　吳慧　李濤　肖丹

〔摘要〕 目的 制備葉酸修飾蟾毒靈陽離子脂質體（FA-BF-CLs），并對其進行質量評價及抗肝癌研究。方法 采用薄膜-超聲分散法制備FA-BF-CLs，以粒徑、Zeta電位及包封率等為指標，采用單因素和Box-Behnken響應面分析法對處方及工藝進行優化。透射電鏡觀察脂質體顯微形態，并考察其體外釋放過程、溶血性及空白陽離子脂質體體外細胞安全性。采用CCK-8法比較FA-BF-CLs、BF-CLs（未加葉酸修飾的蟾毒靈陽離子脂質體）及BF-solution（蟾毒靈溶液）的體外細胞毒性。結果 最佳條件為磷脂與藥物質量比14.17∶1、磷脂與膽固醇質量比3.8∶1、超聲時間13 min，制備得到脂質體粒徑（135.5±1.40） nm，多分散系數0.192±0.025，Zeta電位（16.23±0.46） mV，包封率69.42%±2.18%。體外釋放研究表明，FA-BF-CLs具有明顯的緩釋效果，溶血試驗結果顯示該載體材料無溶血現象。體外細胞安全性結果顯示陽離子脂質體濃度在0～20 μmol/L范圍內安全無毒。體外細胞毒性表明FA-BF-CLs對HepG2肝癌細胞的抑制作用大于BF-CLs和BF-solution（P<0.0.1）。結論 制備得到的FA-BF-CLs外觀均一穩定、具有緩釋性能，空白陽離子脂質體安全無毒，FA-BF-CLs具有更強的體外抗肝癌研究，可用于進一步的研究。

〔關鍵詞〕 蟾毒靈；陽離子脂質體；葉酸；Box-Behnken響應面分析法；肝癌

〔中圖分類號〕R283.6? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.010

Preparation and evaluation in vitro of folic acid-modified bufalin cationic liposomes

LUO Huiting， OUYANG Wei， WANG Xuyi， YAN Hong CHEN Ziyan， WU Hui， LI Tao， XIAO Dan

College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To prepare folic acid-modified bufalin cationic liposomes （FA-BF-CLs） and to evaluate their quality and anti-liver cancer. Methods FA-BF-CLs were prepared by thin-film ultrasonic dispersion method. Moreover， the formulation and process of FA-BF-CLs were optimized by single factor and Box-Behnken response surface analysis with particle size， Zeta potential and encapsulation rate as indexes. The micromorphology of liposomes was observed by transmission electron microscopy， and the in vitro release process， hemolysis and in vitro cell safety of blank cationic liposomes were investigated. The in vitro cytotoxicity of FA-BF-CLs， BF-CLs （bufalin cationic liposomes without folic-acid modification） and BF-solution （bufalin solution） was compared by the CCK-8 method. Results The optimum conditions were as follows： the mass ratio of phospholipid to drug was 14.17∶1， the mass ratio of phospholipid to cholesterol was 3.8∶1， and the ultrasonic time was 13 min. The particle size of liposomes was （135.5±1.40） nm， the polydispersity index was 0.192±0.025， the Zeta potential was （16.23±0.46） mV， and the encapsulation rate was 69.42%±2.18%. The in vitro release study showed that FA-BF-CLs had an obvious sustained release effect， and hemolysis test showed that the carrier material had no hemolysis. The in vitro cell safety result showed that the cationic liposomes were safe and non-toxic in the concentration range from 0 to 20 μmol/L， and the in vitro cytotoxicity tests demonstrated that the inhibitory effects of FA-BF-CLs on HepG2 hepatoma cells were greater than those of BF-CLs and BF-solution （P<0.01）. Conclusion The prepared FA-BF-CLs appears uniform and stable， and possesses sustained release properties， of which the blank cationic liposomes are safe and non-toxic. Moreover， FA-BF-CLs have stronger anti-liver cancer in vitro and can be used for further research.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 bufalin; cationic liposomes; folic acid; Box-Behnken response surface analysis; anti-liver cancer

肝癌，包括原發性和繼發性肝癌，是最為常見的惡性腫瘤之一，目前臨床常采用化療和手術治療肝癌，雖然顯著延長了患者的生存時間，但可能會引起其他正常細胞的死亡以及多藥耐藥性等毒副作用[1]。蟾毒靈（Bufalin， BF）是從蟾酥干燥皮中提取的有效的抗腫瘤單體[2]，研究表明，蟾毒靈可誘導肝癌細胞凋亡、分化和自噬，抑制肝癌的侵襲和轉移，對治療肝腫瘤效果更為顯著[3-5]。陽離子脂質體是一種新型給藥載體，主要由陽離子型材料、中性磷脂及膽固醇組成，可有效地包載藥物[6]。因其表面帶有正電荷，能與帶負電荷的細胞膜脂質產生靜電吸附作用，通過細胞內吞或膜融合的方式將藥物導入細胞從而發揮作用[7]。葉酸受體是一種糖基化磷脂酰肌醇連接的膜糖蛋白，其在大多腫瘤細胞表面過度表達，而在正常細胞表面少量表達甚至不表達[8]。葉酸及其衍生物與葉酸受體之間具有高度親和力，兩者可特異性結合形成復合物，從而實現對腫瘤的主動靶向。此外，有研究[9]顯示陽離子脂質體除了可包載藥物，還可作為基因遞送載體，具有生產成本低、安全性高、生物相容性好等優點，是非常具有發展前景的遞送基因載體之一。

本研究以葉酸為靶向分子，陽離子脂質體為納米載體，制備葉酸修飾蟾毒靈陽離子脂質體（FA-BF-CLs），優化了其處方及工藝條件，對其外觀、顯微形態、粒徑、藥物釋放特性等進行質量評價，并開展了體外抗肝腫瘤活性的研究，為后續共遞送蟾毒靈及基因的陽離子脂質體的研究提供實驗依據，同時為探索蟾毒靈肝靶向新型給藥系統的研究奠定基礎。

1 材料

1.1? 儀器

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀系統（美國安捷倫公司）；01A418型超聲細胞粉碎（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；HT-7800透射電鏡[日立科學儀器（北京）有限公司]；Varioskan Flash多功能酶標儀、Forma Steri-Cycle i250高溫滅菌CO2培養箱（賽默飛世爾科技公司）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2? 試劑與藥物

蟾毒靈對照品（批號：111981-201501，質量分數99.2%，中國食品藥品檢定研究院）；蟾毒靈原料藥（質量分數98%寶雞市辰光生物科技有限公司）；大豆卵磷脂（批號：SY-SO-20081）、膽固醇（CHO-HP，批號：C0073）、DOTAP [（2，3-二油酰基-丙基）-三甲基氯化銨，批號：RD-01917]（上海艾韋拓醫藥科技有限公司）；葉酸（FA-PEG2000-DSPE）（上海梵碩生物有限公司）；乙腈（色譜純，美國斯百全公司）；三氯甲烷、甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3? 細胞

人肝癌HepG2細胞株（批號：CL-0103，武漢普諾賽生命科技有限公司）；人正常肝細胞L-O2細胞株，上海生博生物醫藥公司（批號：SEC1048）。CCK-8試劑盒（批號：E-CK-A362）（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；胎牛血清（FBS，批號：164210-50）、DMEM高糖培養基（批號：PM150210）、青鏈霉素雙抗（批號：PB180120）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法與結果

2.1? HPLC測定蟾毒靈含量

2.1.1? 色譜條件? Waters Xselect HSS T3反相色譜柱（4.6 m×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸二氫鉀溶液（50∶50）；檢測波長296 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.1.2? 蟾毒靈對照品、FA-BF-CLs供試品及陰性溶液的制備? 精密稱取蟾毒靈對照品2.00 mg，甲醇定容至10 mL，即得200 μg/mL的蟾毒靈對照品溶液；精密移取葉酸修飾蟾毒靈陽離子脂質體（FA-BF-CLs）樣品1.0 mL，加入甲醇定容至10 mL破乳，靜置過夜，超聲30 min，過0.45 μm有機微孔濾膜，備用。同樣方法處理空白陽離子脂質體（CLs）樣品作為陰性溶液。

2.1.3? 線性關系考察? 精密移取蟾毒靈對照品溶液，用甲醇定容，得到系列質量濃度為10、20、40、60、80、100、120 μg/mL的對照品溶液，按照“2.1.1”項色譜條件進樣。以峰面積（A）為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，得到其回歸方程A=17.65C-10.776，r2=0.999 1。結果表明，蟾毒靈在10～120 μg/mL與峰面積具有良好的線性關系。

2.1.4? 專屬性考察? 按照“2.1.1”項色譜條件分別進樣蟾毒靈對照品溶液、FA-BF-CLs供試品溶液、陰性溶液。結果顯示，該處方其他輔料成分對蟾毒靈測定無干擾，對照品溶液與供試品溶液的峰形良好，出峰時間一致，表明該測定方法專屬性良好。

2.1.5? 精密度試驗? 精密吸取“2.1.4”項下對照品溶液，按照“2.1.1”項色譜條件連續進樣6 次，計算蟾毒靈的RSD值。結果顯示BF的RSD值為0.29%（n=6），該儀器精密度良好，符合相關要求。

2.1.6? 穩定性試驗? 精密移取FA-BF-CLs供試品溶液1 mL，用甲醇破乳后，于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，按照“2.1.1”項色譜條件進樣，計算蟾毒靈的RSD值。結果顯示，蟾毒靈的RSD值為1.75%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.7? 重復性試驗? 精密吸取FA-BF-CLs樣品1 mL，共6份，按照“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項色譜條件進樣，并計算蟾毒靈的平均含量與RSD值。測定蟾毒靈平均含量為19.86 μg/mL，RSD值為0.22%（n=6），表明該測定方法的重現性良好。

2.1.8? 加樣回收率試驗? 精密吸取9份空白CLs溶液，每份0.5 mL，分為3組，精密加入適量蟾毒靈對照品溶液，搖勻，加入甲醇破乳定容，配成低、中、高質量濃度10、60、120 μg/mL，測定峰面積，計算平均加樣回收率與RSD值。高、中、低3個質量濃度的平均回收率分別為100.87%、99.00%、101.88%，RSD值分別為1.31%、0.44%、0.11%。

2.2? 陽離子脂質體的制備

采用薄膜分散-超聲法[10]制備FA-BF-CLs，精密稱取處方量大豆卵磷脂、膽固醇、DOTAP[（2，3-二油酰基-丙基）-三甲基氯化銨]、葉酸（FA-PEG2000-DSPE）、蟾毒靈于250 mL茄形瓶中，加入三氯甲烷-甲醇（8∶2）溶解完全后，于50 ℃水浴條件下減壓旋轉蒸發至溶劑完全揮干，瓶壁上形成均勻的脂質薄膜，向其中加入pH 6.4 PBS緩沖液，55 ℃下水合，于超聲波細胞粉碎機下探頭超聲，過0.22 μm微孔濾膜得到FA-BF-CLs。同樣方法制備不加葉酸的陽離子脂質體（BF-CLs）、空白陽離子脂質體（CLs）樣品。

2.3? 陽離子脂質體包封率測定

經過文獻研究和摸索實驗發現，透析法在測定FA-BF-CLs包封率時具有準確性高、簡單快捷等優勢[11-12]。精密移取pH 6.4的PBS 100 mL作為透析介質，吸取FA-BF-CLs1 mL放入透析袋中，于30 ℃、磁力攪拌（300 r/min）下透析，透析6 h后吸取3 mL透析介質，加適量甲醇，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，按“2.1.1”項下進行HPLC測定，計算包封率。包封率=[（總藥量-游離藥量）/總藥量]×100%

2.4? FA-BF-CLs制備工藝的單因素考察

2.4.1? DOTAP與磷脂質量比? 稱取30.00 mg磷脂，為DOTAP與磷脂的質量比1∶1、2∶1、3∶1，并稱取處方量蟾毒靈2.000 mg、膽固醇7.500 mg、FA-PEG2000-DSPE 2.000 mg溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2”項下制備FA-BF-CLs，考察粒徑、電位及包封率等變化。結果顯示，隨著DOTAP與大豆卵磷脂質量比增大，電位分別為108.5、112.7、117.5 mV，呈現逐漸上升的趨勢；包封率分別為66.93%、61.61%、58.25%，包封率逐漸減小，因而選用質量比為1∶1進行后續的實驗。

2.4.2? 磷脂與藥物質量比? 以脂質體粒徑、電位、包封率及外觀為指標，稱取2.000 mg蟾毒靈，依次設定磷脂與蟾毒靈的質量比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，稱取處方量DOTAP 30.00 mg、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2”項下制備FA-BF-CLs，結果表明當磷脂與蟾毒靈質量比為5∶1、10∶1、15∶1時，包封率逐漸增大至58.86%；20∶1時包封率下降至最小值23.9%，隨后包封率逐漸增大。此外，隨著磷脂與蟾毒靈質量比逐漸增大，當15∶1時，粒徑最小103.0 nm，隨后粒徑逐漸增大。綜上所述，選用比例15∶1進行后面的處方優化。

2.4.3? 磷脂與膽固醇質量比? 稱取磷脂30.00 mg，依次設定磷脂與膽固醇的質量比為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2項下”制備FA-BF-CLs，考察脂質體粒徑、電位及包封率的變化。結果顯示，隨著比例增大，包封率逐漸減小，粒徑分別為141.4、126.1、110.1、100.5、120.6、123.6 nm，綜合考慮采用比例為4∶1來進行后續的處方優化。

2.4.4? 超聲時間? 超聲是脂質體整粒的過程，合適的粒徑大小（100～200 nm）可為后續實驗奠定重要基礎。以粒徑、電位及包封率的變化為指標，稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、磷脂、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（4∶1）中，按照“2.2”項下以不同超聲時間（15、20、25、30 min）制備FA-BF-CLs。結果顯示超聲時間為15、20、25 min時，粒徑逐漸減小，超聲時間30 min時，粒徑增大至146.3 nm，且隨著超聲時間增加，包封率逐漸減小，故采用超聲時間為15 min。

2.4.5? 水合時間? 稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、磷脂、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，改變水合時間（30、45、60 min），按照“2.2”項下制備FA-BF-CLs，考察脂質體粒徑、電位及包封率的變化。結果顯示，隨著水合時間增加，包封率分別為65.91%、66.93%、65.27%，粒徑與電位相差不大，故選用水合時間45 min。

2.4.6? 水合介質? 以粒徑、電位及包封率的變化為指標，稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、磷脂、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2”項下以水合介質（水、pH 6.4 PBS、pH 6.8 PBS、pH 7.0 PBS、pH 7.2 PBS、pH 7.4 PBS）制備FA-BF-CLs。結果顯示，水合介質種類的不同對粒徑以及電位影響不顯著，包封率先增大后減小，綜合粒徑、電位及包封率等采用pH 6.4 PBS水合介質。

2.4.7? FA與磷脂質量比? 稱取磷脂30.00 mg，依次設定FA-PEG2000-DSPE與磷脂質量比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，并稱取處方量蟾毒靈、DOTAP、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE溶于15 mL三氯甲烷-甲醇（8∶2）中，按照“2.2項下”制備FA-BF-CLs，考察脂質體粒徑、電位及包封率的變化。結果顯示，粒徑及電位相差不大，包封率分別為55.94%、61.47%、62.56%、54.22%，故采用比例為1∶15。

2.5? Box-Behnken響應面分析法

2.5.1? 試驗設計? 根據文獻及單因素考察結果，選擇對FA-BF-CLs評價指標較顯著的3個因素作為考察對象，即磷脂與藥物質量比（X₁）、磷脂與膽固醇質量比（X₂）、超聲時間（X₃），以包封率（Y）作為評價指標進行實驗。實驗設計與結果見表1—2。

2.5.2? ?模型擬合及方差分析? 采用Design-Expert V12.0 軟件，以包封率（Y）對X₁、X₂、X₃進行二次項式回歸方程擬合。回歸方程為：Y=68.19-1.72X₁-2.95X₂-4.45X₃+2.73X₁X₂+2.27X₁X₃-3.47X₂2X₃-9.25 X₁²-5.62X₂²-5.70X₃²。方差分析結果表明，回歸模型P＜0.0001，失擬項水平不顯著（P＞0.05），說明模型擬合良好。此外，磷脂與藥物質量比（X₁）、磷脂與膽固醇質量比（X₂）、超聲時間（X₃）對包封率均具有顯著影響（P＜0.05），各因素之間交互作用不顯著（X₁X₂、X₁X₃、X₂X₃的P＞0.05），且各因素均不是單純的一次關系，而是二次關系。以包封率為評價指標的各因素交互作用響應圖，見圖1。利用Design-Expert V12.0軟件對上述所建立的數學模型進行綜合分析，保證Y與擬合度均最高的前提下，最終確定了各因素的最佳取值：磷脂與藥物質量比14.17∶1、磷脂與膽固醇質量比3.8∶1、超聲時間13 min。

2.5.3? 驗證試驗? 按上述優化后的處方，采用薄膜-超聲分散法以DOTAP與磷脂比1∶1、磷脂與藥物質量比14.17∶1、磷脂與膽固醇質量比3.8∶1及FA與磷脂比1∶1，用三氯甲烷∶甲醇（8∶2）溶解，于50 ℃水浴條件下減壓旋轉蒸發至溶劑完全揮干，瓶壁上形成均勻的脂質薄膜，向其中加入pH 6.4 PBS，55 ℃下水合45 min，于超聲波細胞粉碎機下探頭超聲13 min，過0.22 μm微孔濾膜得到FA-BF-CLs。測得平均包封率為69.35%（n=3），接近理論包封率69.42%（n=3），實測值與預測值較為接近，相對偏差低于3%，說明Box-Behnken響應面預測結果可靠，該工藝優化方法具有可行性。

2.6? FA-BF-CLs的質量評價

2.6.1? FA-BF-CLs的外觀及形態? 在室溫下觀察最佳工藝制備得到的FA-BF-CLs，其外觀澄清透明，呈淡藍色乳光。取FA-BF-CLs適量，滴到銅網上5 min后，用濾紙吸去上面的多余液體，再向銅網滴上1%的磷鎢酸負染2 min，吸干多余液體后在透射電子顯微鏡（TEM）下觀察脂質體的顯微形態。FA-BF-CLs呈規則的球形。詳見圖2。

2.6.2? FA-BF-CLs的粒徑與電位考察? 取FA-BF-CLs適量，用馬爾文粒度測定分析儀測定脂質體粒徑、多分散系數（PDI）、Zeta電位的大小及分布情況，平行測定3次，得到脂質體粒徑為（135.50±1.40） nm，多分散系數為（0.19±0.03），Zeta電位為（16.23±0.46） mV。

2.6.3? 體外釋放性能考察? 采用透析擴散法[13]測定考察FA-BF-CLs、BF-CLs、蟾毒靈溶液的體外釋放性能。取上述樣品1 mL，分別裝入透析袋中，放置于裝有100 mL釋放介質為PBS溶液（pH=7.4）中，置于37 ℃水浴恒溫振蕩器中進行釋放，轉速為100 r/min，分別于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h取出1 mL溶出介質，加入甲醇溶液破乳，并立即補加相同體積的37 ℃空白溶出介質，按照“2.1.1”下測定BF含量并按照以下公式計算累積釋放率（Q/%）。以累積釋放率（Q/%）對時間/t繪制曲線并進行方程擬合，見表3、圖3。結果顯示游離BF溶液12 h的累積釋放率達到97.86%±0.04%以上，而FA-BF-CLs和BF-CLs 12 h累積釋放率分別為75.70%±0.12%、82.59%±0.06%；48 h后FA-BF-CLs、BF-CLs的累積釋放率分別為93.94%±0.04%和99.11%±0.03%，達到最大累積釋放量。相比于游離BF溶液，FA-BF-CLs、BF-CLs兩種陽離子脂質體均表現出一定的緩釋特性。此外，根據表中可知FA-BF-CLs更符合一級動力學模型（R2=0.956 9），具有緩釋性能。

2.6.4? 溶血試驗? 根據2020版《中華人民共和國藥典》四部通則“1148溶血與凝聚檢查法”考察FA-BF-CLs、BF-CLs、CLs對紅細胞的溶血情況，為后續靜脈給藥奠定實驗基礎。取潔凈透明試管27只，分為3組，每組9只，編號，每組中1～6號管為供試品管，7號管為陰性對照管，8號管為陽性對照管，9號管為供試品對照管。依次加入2％紅細胞懸液、生理鹽水、去離子水，混勻后，立即置于（37±0.5） ℃的恒溫箱中進行溫育。通過紫外分光光度法測定溶血率，結果見表4。結果顯示三種制劑溶血率均小于5%，三種制劑均符合2020版《中華人民共和國藥典》對靜脈注射給藥的要求。

2.6.5? 體外細胞安全性考察? 陽離子脂質體作為最常用的非病毒基因載體之一，具有低免疫原性、組織靶向性等優點，但其本身與負電荷的細胞膜發生靜電吸附作用，可能會引起細胞膜的毒性[14]，故采用CCK-8法考察含DOTAP的空白陽離子脂質體對L-O2和HepG2細胞的毒性作用。取對數生長期的L-O2、HepG2細胞以5000個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后，加入不同培養基稀釋的含DOTAP的空白陽離子脂質體（濃度為0、2.5、5、10、20、40 μmol/L），每個濃度6個復孔，繼續放入培養箱中培養24 h后，每孔加CCK-8溶液，繼續于恒溫培養箱中培養。采用酶標儀在450 nm下檢測各孔的吸光度值（OD），結果見圖4。不同濃度的空白陽離子脂質體作用24 h后，L-O2細胞未出現明顯的抑制作用，且經SPSS 26.0軟件分析組間差異無統計學意義（P>0.05）。濃度為0～20 μmol/L的空白陽離子脂質體作用24 h后，HepG2細胞未出現明顯的抑制作用，組間差異無統計學意義（P>0.05）；當濃度為40 μmol/L時，相較于其他組有統計學意義（P<0.001）。綜上所述，空白陽離子脂質體在濃度為0～20 μmol/L范圍內對L-O2及HepG2細胞無明顯的毒性作用。

2.7? 體外細胞毒性試驗

采用CCK-8法考察FA-BF-CLs、BF-CLs、BF-solution（蟾毒靈藥液組，用0.1%二甲基亞砜溶解）對肝癌細胞的毒性。取對數生長期的HepG2細胞以5000個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后，加入不同培養基稀釋的FA-BF-CLs、BF-CLs、BF-solution（蟾毒靈濃度為0.2、0.5、1.0、10、20 μmol/L），每個濃度6個復孔，放入培養箱中培養48 h后，每孔加CCK-8溶液，繼續于恒溫培養箱中培養。采用酶標儀在450 nm下檢測各孔的吸光度值（OD），計算細胞存活率及IC50，結果見圖5。結果顯示，給藥48 h后，與BF-solution相比，FA-BF-CLs、BF-CLs濃度為0.5～20 μmol/L時HepG2細胞的存活率均顯著性降低（P<0.05），表明兩種載藥陽離子脂質體對細胞生長抑制作用明顯優于蟾毒靈藥液組，且經過葉酸修飾的載藥陽離子脂質體的HepG2細胞活性明顯低于未修飾的載藥陽離子脂質體。

3 討論

根據文獻，蟾毒靈在pH 5.8環境中油水分配系數logP值為3.36，屬于疏水性藥物[15]。薄膜-超聲分散法是脂溶性藥物制備脂質體的常用方法，結合預實驗結果采用此方法制備FA-BF-CLs。單因素考察結果表明，隨著DOTAP與大豆卵磷脂質量比增大，電位逐漸升高，參考相關文獻[16]，并綜合考慮DOTAP的價格，采用比例為1∶1進行制備。當大豆磷脂與藥物質量比為15∶1和30∶1時，兩者的粒徑、包封率等結果相差不大，考慮大豆磷脂組成復雜，加入過多可能影響脂質體的穩定性，故而選用大豆磷脂與藥物質量比為15∶1。膽固醇可防止磷脂氧化，對提高脂質體穩定性起到重要作用[17]，結合單因素考察的結果選用大豆磷脂與膽固醇質量比為4∶1。薄膜-超聲分散法制備得到的陽離子脂質體粒徑較大，且分布不均勻[18]，在制備過程中探頭超聲起著至關重要的作用，其目的是使陽離子脂質體分散均勻，增加其穩定性，但因探頭超聲過程中會釋放一定的能量造成局部產熱影響脂質體的形成，故選用超聲時間為15 min。

包封率是脂質體重要的評價指標之一，常用的測定方法有透析法、離心法、葡聚糖凝膠柱層析法、超濾離心法等。預試驗中比較了透析法、離心法以及葡聚糖凝膠柱層析法，但離心法和葡聚糖凝膠柱法均不能使包載藥物的脂質體與游離藥物分離，故對透析法進行方法學考察，結果顯示透析法的加樣回收率均在95%～105%范圍內，且RSD值小于3%，故選用此法測定陽離子脂質體的包封率。體外釋放實驗中，兩種陽離子脂質體均體現了藥物在模擬人體液中緩慢釋放的性能，達到藥物緩釋的效果。溶血試驗顯示空白陽離子脂質體、BF-CLs、FA-BF-CLs均沒有出現棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，無溶血現象，為后續動物體內注射給藥提供了實驗依據。

研究顯示[19]陽離子脂質體與細胞膜靜電作用可能會顯示出細胞毒性，因此對其進行體外細胞安全性考察，結果顯示空白陽離子脂質體濃度為0～20 μmol/L范圍內，L-O2、HepG2細胞均未出現明顯毒性作用，該載體安全無毒，為后續與基因結合時提供實驗依據。體外細胞毒性結果顯示兩種載藥陽離子脂質體對細胞生長抑制作用明顯優于蟾毒靈藥液組，表明陽離子脂質體能更精準靶向HepG2細胞，從而誘導細胞凋亡；經過葉酸修飾的載藥陽離子脂質體的HepG2細胞活性明顯低于未修飾的載藥陽離子脂質體，可能是 FA-BF-CLs攜帶的葉酸與HepG2細胞膜上的葉酸受體結合，通過受體介導的內吞作用介導該載體細胞內轉運，從而將藥物釋放。

綜上所述，本實驗結果為后續制備葉酸修飾共遞送蟾毒靈和基因陽離子脂質體奠定了良好的實驗基礎。

參考文獻

[1] 陳? 成， 劉? 毅， 許漢林. 土田七醇提物抑制肝癌細胞增殖活性部位篩選及其對肝癌細胞侵襲遷移的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2022， 42（6）： 930-933.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 401-402.

[3] WANG H Y， ZHANG C Y， XU L T， et al. Bufalin suppresses hepatocellular carcinoma invasion and metastasis by targeting HIF-1α via the PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. Oncotarget， 2016， 7（15）： 20193-20208.

[4] YANG Z G， TAO Y Q， XU X， et al. Bufalin inhibits cell proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells via APOBEC3F induced intestinal immune network for IgA production signaling pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2018， 503（3）： 2124-2131.

[5] SHENG X， ZHU P F， QIN J M， et al. The biological role of autophagy in regulating and controlling the proliferation of liver cancer cells induced by bufalin[J]. Oncology Reports， 2018， 39（6）： 2931-2941.

[6] 華雪蓮， 張樹彪， 肖? 義， 等. 新型陽離子脂質體制備及應用研究[J]. 化學研究與應用， 2019， 31（2）： 177-183.

[7] 李雙雙， 呂佳琦， 李? 媛， 等. 帕布昔利布和氟維司群共載藥陽離子脂質體的制備和性質評價[J]. 天津科技大學學報， 2021， 36（4）： 8-13， 31.

[8] 余汪洋， 李長軍， 李勇剛. 葉酸修飾的納米結構脂質載體用于基因靶向癌癥治療的研究[J]. 中國新藥雜志， 2017， 26（6）： 692-697.

[9] LI W J， YAN R C， LIU Y， et al. Co-delivery of Bmi1 small interfering RNA with ursolic acid by folate receptor-targeted cationic liposomes enhances anti-tumor activity of ursolic acid in vitro and in vivo[J]. Drug Delivery， 2019， 26（1）： 794-802.

[10] HATTORI Y， SHIMIZU S， OZAKI K I， et al. Effect of cationic lipid type in folate-PEG-modified cationic liposomes on folate receptor-mediated siRNA transfection in tumor cells[J]. Pharmaceutics， 2019， 11（4）： 181.

[11] 蔡曉瑤， 張? 莉， 任? 翔， 等. 離心法和透析法測定蟾皮提取物固體脂質納米粒包封率的比較[J]. 國際藥學研究雜志， 2016， 43（4）： 744-747.

[12] 張? 藝， 杭太俊， 宋? 敏. 載藥脂質體包封率測定方法的研究進展[J]. 中國藥科大學學報， 2021， 52（2）： 245-252.

[13] 高司琪， 駱慧婷， 彭志榮， 等. 肝主動靶向給藥系統研究進展[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2021， 41（2）： 312-317.

[14] ZHAO Y C， ZHENG H L， WANG X R， et al. Preparation and biological property evaluation of novel cationic lipid-based liposomes for efficient gene delivery[J]. AAPS PharmSciTech， 2021， 22： 1-10.

[15] 劉? ?丹， 奉建芳. 蟾酥中3種蟾毒配基組合物的表觀溶解度和表觀油水分配系數的測定[J]. 中國中藥雜志， 2008， 33（11）： 1256-1258.

[16] SUN M， DANG U J， YUAN Y， et al. Optimization of DOTAP/chol cationic lipid nanoparticles for mRNA， pDNA， and oligonucleotide delivery[J]. American Association of Pharmaceutical Scientists， 2022， 23（5）： 135.

[17] 陳李霞， 丁? 越， 沈征武， 等. 膽固醇在脂質體中作用及甾醇、皂苷對其替換的研究進展[J]. 中草藥， 2020， 51（24）： 6396-6404.

[18] 侯麗芬， 谷克仁， 吳永輝. 不同制劑脂質體制備方法的研究進展[J]. 河南工業大學學報（自然科學版）， 2016， 37（5）： 118-124.

[19] KOLA？譒INAC R， BIER D， SCHMITT L， et al. Delivery of the radionuclide 131I using cationic fusogenic liposomes as nanocarriers[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（1）： 457.