基于HPLC-QAMS多指標成分定量與化學計量學的延丹膠囊質量評價研究

華陽　謝飛　周虹　李志明

〔摘要〕 目的 采用高效液相色譜一測多評（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single marker， HPLC-QAMS）法同時檢測延丹膠囊中10種主要成分含量，建立延丹膠囊多組分定量與化學計量學的綜合分析方法，構建延丹膠囊質量評控體系。方法 采用Hedera ODS-2（C18）色譜柱，乙腈-0.1%冰醋酸為流動相，梯度洗脫，檢測波長230 nm（檢測3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇）和280 nm（檢測二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿）；選取丹參酮ⅡA為內參比物質，建立其與其他9種成分的相對校正因子，計算各成分含量，同時運用外標法驗證所建立HPLC-QAMS法的重復性、合理性和可行性；運用化學計量學方法對10批樣品的10種成分含量數據進行分析，挖掘對其質量控制具有顯著貢獻的主要成分。結果 定量分析的10種成分線性關系良好（r>0.999）；平均加樣回收率96.93%～100.14%（RSD<2.0%）；HPLC-QAMS法所測結果與外標法無顯著性差異；偏最小二乘-判別分析結果顯示丹參酮ⅡA、3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、丹參酮Ⅰ和延胡索乙素是影響延丹膠囊產品質量的差異性標志物（VIP值＞1）。結論 所建立的HPLC-QAMS多指標成分定量控制方法操作便捷，重復性與穩定性良好，結果準確可靠，結合化學計量學分析，可用于延丹膠囊的整體質量控制和綜合評價。

〔關鍵詞〕 延丹膠囊；多指標成分；高效液相色譜一測多評法；相對校正因子；化學計量學；質量評價

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.014

Quality evaluation of Yandan Capsule by multi-component content determination using

HPLC-QAMS and chemometrics

HUA Yang XIE Fei ZHOU Hong LI Zhiming

1. Department of Pharmacy， The People's Hospital of Hai'an， Hai'an， Jiangsu 226600， China; 2. College of Pharmacy，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210023， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To determine the content of 10 main components in Yandan Capsule （YDC） by high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker （HPLC-QAMS） method simultaneously and to establish a comprehensive analysis method for multi-component quantification and chemometrics of YDC so as to construct a quality evaluation and control system for YDC. Methods The gradient elution was performed on a Hedera ODS-2 （C18） column with acetonitrile-0.1% glacial acetic acid as the mobile phase. The detection wavelengths were set at 230 nm for 3， 29-dibenzoyloxykarounidiol and 3， 29-dibenzoyl rarounitriol， and 280 nm for dihydrotanshinone Ⅰ， cryptotanshinone， tanshinone Ⅰ， tanshinone ⅡA， protopine， tetrahydropalmatine， corydaline and tetrahydroberberine. Tanshinone ⅡA was selected as the internal reference substance to establish the relative correction factors with the other 9 components， the content of each component was calculated and the repeatability， rationality and feasibility of the established HPLC-QAMS method were verified by external standard method （ESM）. The content data of 10 components in 10 batches of samples were analyzed by chemometrics， and the main components that contributed significantly to its quality control were explored. Results The 10 components by quantitative analysis had a good linear relationship （r>0.999）; the average recoveries of the 10 components were 96.93%～100.14% （RSD<2.0%）; there was no significant difference between the quantitative results of HPLC-QAMS and ESM; the results of partial least squares-discriminant analysis showed that tanshinone ⅡA， 3，29-dibenzoyl rarounitriol， tanshinone I and tetrahydropalmatine were the differential markers affecting the quality of YDC （VIP>1）. Conclusion With good repeatability and stability， the established HPLC-QAMS multi-index component quantitative control method is convenient to operate， and the results are accurate and reliable. Combined with chemometric analysis， it can be used for overall quality control and comprehensive evaluation of YDC.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yandan Capsule; multi-index component; high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker; relative correction factors; chemometrics; quality evaluation

延丹膠囊由瓜蔞、丹參、醋延胡索、五靈脂、醋乳香、白芍、枳殼和柴胡組方而成，具有活血祛瘀、理氣止痛的臨床功效，主要用于氣滯血瘀引起的胸痛、胸悶、心慌、憋氣類冠心病勞累性心絞痛的治療[1]。現代研究表明，延丹膠囊聯合阿司匹林可有效降低冠心病患者氧化應激水平，調節血清胱抑素C和纖溶酶原激活物抑制物-1水平，促進心功能恢復[2]；通過改善抗氧化應激水平，減少心肌炎癥，發揮抗凋亡作用，對異丙腎上腺素誘導SD大鼠心肌缺血模型具有顯著的改善作用[3]。目前，延丹膠囊執行標準為國家食品藥品監督管理局國家藥品標準YBZ04452005-2009Z，質量標準和文獻報道僅對該制劑1～3種成分進行了含量檢測[4]，未對檢測結果進行綜合評價。中成藥所含化學成分繁多，現有質控標準不能表征其整體質量的差異性。本實驗選取延丹膠囊君藥丹參成分二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA，臣藥醋延胡索成分原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿，佐藥瓜蔞成分3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇為指標性成分，同時以丹參酮ⅡA為內參比物質，采用高效液相色譜一測多評（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single marker， HPLC-QAMS）法對以上10種成分同時進行含量測定，并結合化學計量學方法發現多種成分含量數據間潛在的關聯性，挖掘影響質量差異的主要成分，為延丹膠囊的整體質量控制和綜合評價提供數據支持。

1 材料

1.1? 試藥

對照品隱丹參酮、原阿片堿、丹參酮ⅡA和延胡索乙素（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110852-201807、110853-201805、110766-202022和110726-202020，含量均不低于99.0%）；對照品二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、紫堇堿和四氫小檗堿（成都普瑞法科技開發有限公司，批號分別為PRF9072403、PRF9091108、PRF10022126和PRF8050941，含量均不低于98.8%）；對照品3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇（武漢天植生物技術有限公司，批號分別為CFS201901、CFS202101，含量均為98.0%）；延丹膠囊（天長億帆制藥有限公司，規格：0.3 g/粒，批號：200902、201001、210105、210109、210201、210914、211203、211207、220203和220301，編號依次為S1～S10）；乙腈和冰醋酸為色譜純級別，其余試劑為分析純。

1.2? 儀器

高效液相色譜儀（UltiMate 3000型，美國熱電公司；Waters e2695型，Waters公司）；Hedera ODS-2（C18）柱、Thermo BDS C18柱和Durashell C18柱（規格均為：5 μm，250 mm×4.6 mm）；電子分析天平（Mettler Toledo公司，XSE205DU型）；高頻數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司，KH-700TDB型）。

2 方法與結果

2.1? 混合對照品溶液的制備

取各對照品適量，用70%甲醇制成含3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇0.096 mg/mL、3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇0.322 mg/mL、二氫丹參酮Ⅰ0.258 mg/mL、隱丹參酮0.592 mg/mL、丹參酮Ⅰ0.714 mg/mL、丹參酮ⅡA 1.130 mg/mL、原阿片堿0.128 mg/mL、延胡索乙素0.450 mg/mL、紫堇堿0.376 mg/mL、四氫小檗堿0.292 mg/mL的混合對照品貯備液，再精密吸取貯備液1.0 mL，用同一溶劑稀釋20倍制得混合對照品溶液。

2.2? 供試品溶液的制備

取延丹膠囊內容物混勻，取適量，研細。精密稱取上述粉末2.0 g，加70%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，70%甲醇定容至25 mL，搖勻，過濾，即得延丹膠囊供試品溶液。取按質量標準中處方及制備流程制備的缺瓜蔞、缺丹參和缺醋延胡索的陰性供試品各適量，按上述方法制得陰性供試品溶液。

2.3? 色譜條件及專屬性試驗

色譜柱Hedera ODS-2（C18），柱溫30 ℃，進樣量10 μL；檢測波長分別為230 nm（0～17 min檢測3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇）[5-7]、280 nm（17～60 min檢測二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿）[8-18]；流動相乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），流速1.0 mL/min，梯度洗脫：0～11 min，7.0% A；11～17 min，7.0% A→30.0% A；17～34 min，30.0% A→55.0% A；34～50 min，55.0% A→78.0% A；50～60 min，78.0% A→7.0% A。在上述色譜條件下進樣混合對照品溶液及供試品溶液，記錄色譜流出曲線（見圖1）。曲線圖顯示基線平穩，混合對照品溶液與供試品溶液在相同保留時間處均有相應的色譜峰出現，分離度均≥1.5；陰性供試品對延丹膠囊供試品的檢測未產生干擾。

2.4? 方法學考察

2.4.1? 線性關系考察? 精密吸取混合對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別用同一溶劑定容至20 mL，搖勻制得序號為1～6的混合對照品溶液，按“2.3”項色譜條件檢測，以對照品質量濃度對峰面積進行線性回歸，結果見表1。

2.4.2? 精密度考察? 取2.2項下供試品溶液（編號：S1）一份，按“2.3”項色譜條件連續進樣6次，記錄3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇、3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿色譜曲線，結果峰面積的RSD值依次為1.33%、1.06%、1.18%、0.98%、0.87%、0.57%、1.30%、1.09%、1.14%、1.22%（n=6），表明精密度良好。

2.4.3? 穩定性考察? 取延丹膠囊（編號：S1）供試品溶液一份，于制備后0、2、4、6、10、16、24 h進樣，記錄3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇、3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿色譜曲線峰面積，結果峰面積的RSD值依次為1.34%、1.03%、1.16%、1.01%、0.84%、0.59%、1.29%、1.12%、1.11%、1.20%（n=7），表明延丹膠囊供試品溶液24 h內穩定。

2.4.4? 重復性考察? 取延丹膠囊（編號：S1）6份，每份2.0 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.3”項色譜條件下檢測，用外標法計算3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇、3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的含量，結果含量的RSD值依次為1.88%、1.66%、1.74%、1.38%、1.29%、1.21%、1.79%、1.52%、1.61%、1.68%（n=6），表明重復性良好。

2.4.5? 加樣回收率實驗? 取延丹膠囊（編號：S1）細粉9份，每份精密稱定1.0 g，分別加入混合對照品溶液（含3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇0.052 mg/mL、3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇0.239 mg/mL、二氫丹參酮Ⅰ 0.187 mg/mL、隱丹參酮0.489 mg/mL、丹參酮Ⅰ0.607 mg/mL、丹參酮ⅡA 0.928 mg/mL、原阿片堿0.086 mg/mL、延胡索乙素0.357 mg/mL、紫堇堿0.302 mg/mL和四氫小檗堿0.216 mg/mL的溶液）0.8、1.0、1.2 mL（各3份），再按“2.2”項方法制得加樣供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下檢測，得各成分的平均加樣回收率為96.93%、97.92%、98.52%、99.34%、99.08%、100.14%、97.48%、98.73%、98.04%、97.90%；RSD分別為1.44%、0.90%、1.28%、1.50%、1.22%、0.75%、1.34%、1.61%、1.17%、1.31%（n=9）。

2.5? HPLC-QAMS法

2.5.1? 相對校正因子（fi/s）的計算? 在一定線性范圍內各成分的量與檢測器的響應值成正比。試驗取“2.4.1”項6個混合對照品溶液，在“2.3”項色譜條件下檢測，記錄色譜曲線。以丹參酮ⅡA為參照物（丹參酮ⅡA質穩易得且價廉），計算各成分校正因子（fi/s）：fi/s=fi/fs=（ρ_i/A_i）/（ρ_s/A_s）=（ρ_i×A_s）/（ρ_s×A_i）（式中f_i/s、ρ、A、i、s依次代表相對校正因子、質量濃度、峰面積、參照物和其他待測成分）。詳見表2。

2.5.2? 色譜峰定位? 采用相對保留時間值法對待測成分色譜峰進行定位，結果（見表3）測得RRT的RSD在0.81%～1.72%之間（n=6），表明采用相對保留時間值法可以對目標化合物色譜峰進行準確定位。

2.6? 外標法與HPLC-QAMS法含量測定結果

取10批延丹膠囊（S1～S10）供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下檢測，分別運用ESM和HPLC-QAMS法計算延丹膠囊中3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇等10種成分的含量（見表4）。再運用SPSS 26.0統計軟件對每一成分的兩組數據進行t檢驗，結果兩種方法無顯著性差異（P＞0.05），表明HPLC-QAMS法用于延丹膠囊中3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇等10種成分的含量測定是可行的。

3 延丹膠囊的化學計量學質量分析

3.1? 聚類分析（cluster analysis， CA）

將10批延丹膠囊中3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇等10個成分一測多評法測定結果導入SPSS 26.0統計軟件，通過組間連接聚類法，以歐氏距離為度量標準進行CA，得聚類樹狀圖。從圖2看出當判別條件距離為15時，10批延丹膠囊樣品被分為三大類，一類包括S7、S8和S6，二類包括S2、S5、S3、S4和S1，三類包括S9、S10。

3.2? 主成分分析（principal component analysis， PCA）

將10批延丹膠囊中3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇等10個成分一測多評法的測定結果導入SPSS 26.0統計軟件進行PCA，得表5—6。以特征值大于1為提取標準，10批延丹膠囊有2個主成分，其特征值分別為6.171和2.931，對方差的貢獻率分別為61.708%和29.307%，累計貢獻率為91.015%，表明前2個主成分可反映樣品的整體信息。表6顯示二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿等成分的綜合為第一主成分的信息，第二主成分解釋了3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇、3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、丹參酮Ⅰ的信息。再運用SIMCA 14.1統計軟件對10批延丹膠囊中3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇等10個成分建立PCA模型（見圖3），共提取出2個主成分R2X為0.910，大于0.5，所建立的模型穩定性較高。圖3顯示S1～S5、S6～S8以及S9～S10分別呈現一定相關性，與CA結果一致。

3.3? 偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discrimination analysis， PLS-DA）

將10批延丹膠囊中10個成分一測多評法測定的結果導入SIMCA 14.1統計軟件進行PLS-DA，結果得到PLS-DA（R2X＝0.927、Q2＝0.727）模型，篩選出4個色譜峰的變量重要性投影（variable importance for projection， VIP）值大于1，即成分6（丹參酮ⅡA，VIP=1.664）、成分2（3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇，VIP=1.469）、成分5（丹參酮Ⅰ，VIP=1.160）和成分8（延胡索乙素，VIP=1.009）對延丹膠囊樣品質量的影響較大，可能是影響延丹膠囊產品質量的主要潛在標志物（VIP>1）。

4 討論

4.1? 指標性成分的選擇

延丹膠囊由丹參、延胡索（醋制）、五靈脂、瓜蔞、乳香（醋制）、白芍、枳殼、柴胡配方而成。方中丹參活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰，為君藥，其主要活性成分以二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA為代表；醋延胡索、五靈脂和醋乳香助丹參行氣活血止痛，共為臣藥；白芍、枳殼、柴胡、瓜蔞具有疏肝解郁、理氣寬胸之效，共為佐使藥。諸藥合用有活血化瘀、理氣止痛的作用。根據中藥質量標志物選取原則，本實驗選取君藥丹參代表性成分二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA，臣藥醋延胡索主要成分原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿，佐藥瓜蔞代表性成分3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇和3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇為定量控制指標成分，采用HPLC-QAMS法對上述成分含量同時進行檢測。同時選取含量較高，出峰時間較居中，且質量較為穩定的丹參酮ⅡA為內參比物質。

4.2? 供試品溶液制備方法的確定

本試驗在篩選供試品溶液制備方法時，通過對提取溶媒的種類、提取方法和提取時間3個因素進行考察，結果發現70%甲醇超聲提取30 min時，3，29-二苯甲酰基栝樓仁二醇等10種成分的提取率最高，雜質干擾最少。

4.3? HPLC-QAMS法與化學計量學結果評價

HPLC-QAMS法測定延丹膠囊中10種成分含量，通過與外標法比較，結果顯示兩種方法差異性較小（P＞0.05），表明HPLC-QAMS法是可行的，為該制劑多指標成分質控方法的普及應用提供了有利支持；CA和PCA的結果表明10批延丹膠囊聚為3類。PLS-DA分析的分析結果顯示丹參酮ⅡA、3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、丹參酮Ⅰ和延胡索乙素等成分可能是影響延丹膠囊產品質量的主要潛在標志物。中藥復方制劑一般由多味中藥材組方而成，所含成分復雜，同一原藥材即使符合同一藥品標準，但其地域、氣候不同可能造成所含成分差異較大，導致使用該藥材生產的制劑質量差異也較大，從而產生不同的治療作用。

本試驗采用HPLC-QAMS法建立了延丹膠囊10種指標成分定量質控模式，對市場流通的10批不同階段生產的樣品進行檢測，同時聯合化學計量學識別模式進行綜合分析，發掘出了影響產品質量差異性的主要物質性成分，為提高延丹膠囊質控水平及整體質量，確保產品質量穩定和臨床治療效果的一致性提供了實驗基礎。

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