基于ATR-FTIR研究藥食同源植物多花黃精的產地分布

蔣芙蓉　江星明　黃良輝　夏新斌　何雄　袁志鷹

〔摘要〕 目的 基于傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（attenuated total reflection-flourier transformed infrared spectroscopy， ATR-FTIR）研究藥食同源植物多花黃精的產地分布。方法 采用 ATR-FTIR 技術采集不同產地多花黃精粉末樣本的紅外光譜數據，通過紅外譜圖的波數分析其對應的官能團，并進行精密度、重復性、穩定性的方法學考察試驗。譜圖數據經預處理后，建立主成分分析（principal components analysis， PCA）模型和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis， OPLS-DA）模型，進行多元統計數據分析。結果 不同產地多花黃精ATR-FTIR圖譜的峰形、峰位差異微小。運用PCA和OPLS-DA可視化處理不同產地多花黃精的數據，發現7種不同產地多花黃精代謝輪廓差異明顯，可對不同產地的多花黃精進行輔助鑒別。結論? ATR-FTIR技術操作簡單，環保經濟，可為多花黃精質量控制提供技術參考。

〔關鍵詞〕 多花黃精；傅里葉變換衰減全反射紅外光譜；正交偏最小二乘判別分析；產地；質量控制

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.015

Geographical distribution of the medicinal and edible plant Polygonatum cyrtonema Hua

based on ATR-FTIR

JIANG Furong JIANG Xingming HUANG Lianghui XIA Xinbin HE Xiong YUAN Zhiying

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Kelun Pharmaceutical Co.， Ltd， Yueyang， Hunan 414100， China; 3. Key Laboratory of TCM Heart and Lung Pattern Differentiation， Medicated Diet & Dietotherapy， Changsha， Hunan 410208， China; 4. Hunan Center for Drug Evaluation & ADR Monitoring， Changsha， Hunan 410013， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the geographical distribution of the medicinal and edible plant Polygonatum cyrtonema Hua based on attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy （ATR-FTIR）. Methods The infrared spectrum data of Polygonatum cyrtonema Hua powder samples from different places of origin were collected by ATR-FTIR technology. Moreover， the corresponding functional groups were analyzed by the wave number of the infrared spectrum， and the methodological investigation test of the precision， repeatability and stability was carried out. After preprocessing the spectral data， the orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA） model and the principal component analysis （PCA） model were established for multivariate statistical data analysis. Results The peak shape and position of the ATR-FTIR spectra of Polygonatum cyrtonema Hua from different places of origin were slightly different. The PCA and OPLS-DA were adopted to visualize the data of Polygonatum cyrtonema Hua from different places of origin. It was found that the metabolic profiles of Polygonatum cyrtonema Hua from 7 different places of origin were significantly different， which could assist in the identification of Polygonatum cyrtonema Hua from different places of origin. Conclusion ATR-FTIR technology is simple to operate， environmental friendly and economic， which can provide technical reference for the quality control of Polygonatum cyrtonema Hua.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Polygonatum cyrtonema Hua; attenuated total reflection-flourier transformed infrared spectroscopy; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; places of origin; quality control

黃精為我國傳統藥食同源植物，性味甘、平，歸脾、肺、腎經，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎等功效，《中華人民共和國藥典》2020版中收載的黃精為百合科植物滇黃精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖[1]。我國黃精資源豐富，其中多花黃精主要分布在湖南、湖北、陜西以及江西等地[2]。黃精含有多糖、酚類成分、氨基酸和礦質元素，具有抗氧化、降血糖、調節免疫的功效，是多種功能性食品的主要原料[3-7]。藥食同源用藥材產地講究道地，不同地區所產多花黃精的有效成分會有一定差異，目前市場中以次充好的現象屢見不鮮。當前，鑒別黃精真偽的主流方法多采用性狀、薄層色譜法、顯微觀察等鑒別方法，但這些方法囿于樣本形態、鑒別人員等因素，難以識別產地來源。

隨著分子生物學的不斷發展，采用分子鑒定技術也可以對藥用植物進行鑒別，而且鑒別結果更加準確，但目前此方法鑒別成本較高，其操作也相對復雜[8]。傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（attenuated

total reflection-fourier transform infrared spectroscopy， ATR-FTIR），由于其具有無損、快速、簡便、成本低、重現性好等特點[9]，近年來已廣泛應用于生藥學、食品、生物、環境、塑料、紡織、農業等多領域的分析與檢測[10-12]。在藥食同源領域，姚沖等人利用 ATR-FTIR對不同產地西紅花進行判別；李秀麗等基于ATR-FTIR和1H NMR發現高溫可改變牡丹籽油脂肪酸、酸值等品質指標[13-14]。

主成分分析（principal component analysis， PCA）根據主成分的得分，可以描繪n個樣本在二維或三維圖上的分布情況，由此可以直觀的對樣本進行分類處理。正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial latent squares-discriminant analysis， OPLS-DA）是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，可以去除自變量X中與分類變量Y無關的數據變異，使得模型變得簡單和易于解釋，該方法在代謝組學、轉錄組學等領域已廣泛使用[15]。

本文采用ATR-FTIR 技術結合代謝組學多元統計分析策略開展了7個不同產地共70批次多花黃精樣本中的代謝輪廓差異研究，可對不同產地的多花黃精進行輔助鑒別。ATR-FTIR技術操作簡單，環保經濟，作為食品藥品領域分析研究的技術平臺，可為藥食同源大品種-多花黃精質量控制提供技術參考。

1 儀器與材料

電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司，DHG-9145A）；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司，FW100）；傅里葉變換紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司，Nicolet iS5）。

試驗選用7個不同產地黃精，經湖南中醫藥大學藥學院周日寶教授鑒定為多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖。每個產地10 批次樣本，共70批次樣本作為本試驗研究對象，具體信息見表1。

2 實驗方法

2.1? 圖譜數據采集

將干燥的多花黃精樣品粉碎，過 200 目篩得到極細粉。取樣品粉末約0.05 g均勻平鋪在ATR附件上，調節壓力塔，使樣品粉末與ATR附件緊密接觸。設置紅外采集條件：分辨率4 cm^-1，光譜掃描波數范圍600～5500 cm^-1，空白背景光譜掃描32次，自動扣除大氣背景CO₂、H₂O的影響，樣本掃描16次。所得圖譜均經過OMNIC-9.2軟件中的“自動基線校正”和“透過率%”轉換處理。

2.2? 方法學考察

按“2.1”方法采集譜圖，OMNIC自動標峰6個吸收強度最大的特征峰波數，如樣本Anhui 02（見圖1），特征峰波數分別是3339.33、2939.87、1623.71、1 415.58、1032.51、932.10 cm^-1，以此6個特征峰波數分別計算RSD值，并考察精密度、重復性、穩定性。

2.3? 多元統計數據分析

將ATR-FTIR導出的數據經預處理后導入 SIMCA-14.1軟件（瑞典Umetrics公司），進行PCA和OPLS-DA多元統計數據分析。

3 結果

3.1? 方法學考察

3.1.1? 精密度? 取樣本Anhui 01連續測定6次，得紅外光譜圖，標峰，記錄6個特征峰波數，計算對應的RSD值，結果分別是0.24%、0.03%、0.03%、0.01%、0.03%、0.04%，表明本實驗所用光譜儀的儀器精密度良好。

3.1.2? 重復性? 取樣本Anhui 01分為6份，平行測定6次，得紅外光譜圖，標峰，記錄6個特征峰波數，計算對應的RSD值，結果分別是0.24%、0.06%、0.02%、0.02%、0.13%、0.09%，表明本實驗測定方法重復性良好。

3.1.3? 穩定性? 取樣本Anhui 01分別在0、1、2、4、6 h進行測定，得紅外光譜圖，標峰，記錄6個特征峰波數，計算對應的RSD值，結果分別是0.14%、0.09%、0.19%、0.02%、0.12%、0.06%，表明該樣本在6 h內穩定性良好。

3.2? 譜圖分析

通過查閱文獻資料對多花黃精主要特征峰波數進行歸屬，并推斷其可能的貢獻物。特征峰波數3339 cm^-1主要歸屬為N-H伸縮振動、-OH伸縮振動，可能貢獻物為蛋白質、生物堿類[16-17]；2939 cm^-1主要歸屬為飽和C-H伸縮振動，可能貢獻物為脂肪酸化合物[18]；1623 cm^-1主要歸屬為C=C伸縮振動，可能貢獻物為烯類化合物[19]；1415 cm-1主要歸屬為-OH彎曲振動，可能貢獻物為多糖類化合物[16-17]；900～1200 cm^-1主要歸屬為C-O、C-OH伸縮振動，可能貢獻物為單糖類、多糖類化合物[16-17]。

由此推斷多花黃精紅外光譜圖主要由多糖類、蛋白質類、生物堿類、脂類等吸收帶組成。將70批次多花黃精紅外光譜圖疊加（見圖1），由圖1可看出，不同批次樣本總體上峰形相似，峰位基本相同，但仍然具有細微差別，為此需要建立PCA、OPLS-DA模型來進行多元統計分析。

3.3? 多元統計數據分析結果

3.3.1? PCA? 將ATR-FTIR導出的數據經預處理后導入 SIMCA-14.1軟件，設置model-type為PCA-X，Autofit進行擬合，點擊scores得到主成分分析得分圖（見圖2A），將數據可視化后能觀察到7個不同產地多花黃精能夠很好的分類。設置Hotelling's T2，篩選極少數離群樣本，通過SIMCA軟件中離群（Outlier）圖（見圖2B）分析可知，樣本Anhui 03、Guangxi 01為離群樣本，去除離群值后，再重新擬合。離群樣本出現此現象的原因有很多，藥用植物的品質受產地環境、產地初加工、種養條件、藥材年齡差異等多種因素的影響[20]。

將離群樣本合理去除后，提取了3個主成分，其累計貢獻率為94.27%。其中第一主成分PC1貢獻率為76.76%，第二主成分PC2貢獻率為11.17%，第三主成分PC3貢獻率為6.34%，模型中R²X（累計解釋參數能力）值為0.943，Q²（預測能力參數）值為0.938，均高于0.5，說明該模型穩定性和預測性良好，能較為全面的反映樣品間的差異。從圖2中能清晰看到同一產地更趨向于聚在一起，不同產地會有所區分。其中懷化、新化、新邵這3個產地都是在湖南省內，地理位置相對較近。雖然這3個產地兩兩之間也能明顯區分，但從圖中整體來看，這3個產地的多花黃精有一定的靠近的趨勢，一定程度上說明產地相近的多花黃精，其成分差異可能更小。

3.3.2? OPLS-DA? OPLS-DA二維得分圖在兩兩分析中具有更好的區分性，因此對樣本類型兩兩一組，設置model-type為OPLS-DA，進行模型擬合（部分樣本見圖2C—F）。OPLS-DA能夠進一步對2個不同產地樣本間進行判別分析，提取出3個主成分，模型中質量參數R²X_cum（反映X矩陣的解釋率）、R²Y_cum（反映模型的穩定性）和Q²_cum（反應模型的預測性）三者值分別為0.980、0.921和0.840，均大于0.5，表明所建立的模型穩定性和預測性均良好。利用OPLS-DA圖能夠更加直觀準確的區分兩個不同產地的多花黃精。

最后檢驗OPLS-DA有無過擬合，對Y矩陣變量進行隨機分組200次的置換檢驗（見圖3）。模型驗證結果顯示置換參數擬合截距（R²intercepts）為0.265（應小于0.4），預測截距（Q²intercepts）為-0.674（應小于0），表明所建的模型具有較高的可靠性，不存在過度擬合現象。

4 結論

多花黃精作為我國一種傳統補益類中藥材，且能藥食兩用，在各大中藥材及食品原材料市場十分常見。湖南新化、懷化等湘中地區和安徽九華地區等地生產的黃精品質優良，如新化黃精獲得中國地理標志證明商標，黔陽黃精、安化黃精和九華黃精分別獲得國家農產品地理標志。黃精的產地主要依賴外觀性狀和經驗來鑒定，但是打粉后的黃精藥材產地難以識別。目前，隨著中藥代謝組學研究的興起，基于高通量數據研究可以輔助對中藥的道地性進行評價，而國內外中藥代謝組學研究主要采用LC/MS、GC/MS、1H-NMR、GC/IMS、ATR-FTIR等技術[21-22]，在這些技術平臺中，ATR-FTIR技術具有儀器價格相對低廉、操作簡便、無損檢測、原位測試等優點。周曄等[23]利用傅里葉紅外光譜法對部分黃精屬生藥進行鑒別，研究過程中確定了共有峰和變異峰，通過共有峰率和變異峰率的高低對不同種屬黃精的親緣關系和成分差異做關聯性研究，并用來判斷藥食兩用植物的親緣關系，具有實際應用價值。

本研究在前人研究基礎上，運用ATR-FTIR 技術對70批次不同產地多花黃精紅外光譜圖分析發現，多花黃精光譜可能主要由多糖類、蛋白質類、生物堿類、脂類等物質吸收帶等組成。樣本間圖譜大致相同，但仍然存在細微差異，通過SIMCA軟件的 PCA、OPLS-DA模型能夠對不同產地的多花黃精進行代謝輪廓差異分析，證實了不同產地的多花黃精存在著差異，而產地相近的多花黃精，其差異可能會更小，此種差異可能是由多花黃精中化合物的種類或含量引起的，這也為藥食兩用中藥的“道地性”提供了一定的理論依據。而樣本中出現的離群樣本，其原因可能是多樣的：如個別多花黃精的質量問題或者多花黃精的產地加工等多種因素有關，今后還需要進一步探究。綜上，ATR-FTIR 技術以其綠色、便捷、不損耗樣本的特點，并結合多元統計數據分析，能夠更準確、有效地將數據可視化，對藥食兩用類藥材粉末的鑒別和質量控制具有十分重要的意義。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 319-320.

[2] 李亞霖， 周? 芳， 曾? 婷， 等. 藥用黃精化學成分與活性研究進展[J]. 中醫藥導報， 2019， 25（5）： 86-89.

[3]陶愛恩， 杜澤飛， 趙飛亞， 等. 基于多糖組成和含量的3種基原黃精質量比較和識別研究[J]. 中草藥， 2019， 50（10）： 216-222.

[4] 于純淼， 劉? 寧， 宮銘海， 等. 黃精藥理作用研究進展及在保健食品領域的應用開發[J]. 黑龍江科學， 2019， 10（18）： 66-68.

[5] 張澤銳， 黃? 申， 劉京晶， 等.多花黃精和長梗黃精花主要營養功效成分[J].中國中藥雜志， 2020， 45（6）： 1329-1333.

[6]唐蘭芳， 王? 鋒， 蘇小軍， 等. 低共熔溶劑提取對黃精多糖性質及抗氧化活性的影響[J]. 食品與發酵工業， 2021， 47（11）： 151-157.

[7] 秦? 臻， 韋正新， 宰青青， 等. 黃精降低活性氧水平促進衰老內皮祖細胞功能的研究[J]. 中國藥理學通報， 2019， 35（1）： 123-127.

[8] 王? 慶. 藥用植物黃精鑒別研究進展[J]. 現代園藝， 2020， 43（13）： 35-37.

[9] 張紅梅， 郭西華. 應用紅外光譜法鑒定中藥材射干質量[J]. 光譜實驗室， 2008， 25（4）： 609-610.

[10] 王寶慶， 金哲雄， 布現立， 等. 紅外光譜技術在傳統中藥領域的研究進展[J]. 生命科學儀器， 2010， 8（3）： 37-39.

[11] 蔡碧瓊， 蔡向陽， 張福娣. 衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜技術的發展及應用[J]. 武夷科學， 2004， 20（1）： 192-194.

[12] YANG L，? YANG L，? SUN S， et al. Cascading chemical transitions of rhubarb （Rhei Radix et Rhizoma） during the scorching process revealed by heated ATR-FTIR spectroscopy and two-dimensional correlation analysis[J]. Journal of Molecular Structure， 2020， 1216： 128307.

[13] 姚? 沖， 錢曉東， 李麗琴， 等.ATR-FTIR結合RBF神經網絡對市售西紅花的產地溯源[J]. 中華中醫藥學刊， 2019， 37（6）： 1323-1326.

[14] 李秀麗， 戢小梅， 陳志偉， 等. 基于ATR-FTIR和1H NMR研究高溫對牡丹籽油品質特性的影響[J]. 中國糧油學報， 2019， 34（10）： 63-68， 76.

[15] GORGULU S T，? DOGAN M，? SEVERCAN F. The characterization and differentiation of higher plants by fourier transform infrared spectroscopy[J]. Applied Spectroscopy， 2007， 61（3）： 300-308.

[16] CHENG C，? LIU J，? CAO W， et al. Classification of two species of Bidens based on discrete stationary wavelet transform extraction of FTIR spectra combined with probability neural network[J]. Vibrational Spectroscopy， 2010， 54（1）： 50-55.

[17] BYLESJO M， RANTALAINEN M， CLOAREC O， et al. OPLS discriminant analysis： Combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification[J]. Journal of Chemometrics， 2006， 20： 341-351.

[18] 彭婧超， 熊蘇慧， 萬? 燕， 等. 基于ATR-FTIR結合化學計量學快速鑒別玉竹和黃精的實驗研究[J]. 湖南中醫雜志， 2019， 35（10）： 157-160.

[19] 范佐旺， 柯曉燕， 陳靚雯， 等. 多花黃精的化學成分及藥理研究進展[J]. 中醫藥信息， 2020， 37（5）： 119-126.

[20] 陳? 怡， 姚云生， 陳松樹， 等. 多花黃精不同齡節藥材質量研究[J]. 福建農業學報， 2020， 35（1）： 38-43.

[21] YUAN Z Y，? Li Z Y， ZHAO H Q， et al. Effects of different drying methods on the chemical constituents of Lilium lancifolium Thunb. based on UHPLC-MS analysis and antidepressant activity of the main chemical component regaloside A[J]. Journal of Separation Science， 2021， 44（5）： 992-1004.

[22] YUAN Z Y，? LI J，? ZHOU X J， et al. HS-GC-IMS-Based metabonomics study of Baihe Jizihuang Tang in a rat model of chronic unpredictable mild stress[J]. Journal of Chromatography B， 2020， 1148（6）： 122-143.

[23] 周? 曄， 李佩孚， 張慶偉， 等. 傅里葉紅外光譜法鑒別部分黃精屬生藥的研究[J]. 光譜學與光譜分析， 2013（7）： 1791-1795.