卵巢癌組織中TTF-1、CyclinD1的表達及其與淋巴管生成關系的研究

張鑫?嚴倩文?王路祎

【摘要】目的 探討甲狀腺轉錄因子1（TTF-1）和細胞周期蛋白D1（CyclinD1）在卵巢癌組織中的表達情況，分析其與淋巴管生成的關系。方法 收集60例卵巢癌組織樣本和20例經病理檢查證實的正常卵巢組織。制備組織切片進行TTF-1、CyclinD1和D2-40免疫組織化學（免疫組化）染色，基于半定量積分法評價TTF-1、CyclinD1染色結果。依據Weidner評價方法評估D2-40染色結果，計算淋巴管密度（LVD）。結果 TTF-1和CyclinD1的陽性表達率在卵巢癌組織中分別為58%和83%，均高于其在正常卵巢組織中的5%和10%（P均< 0.001）。病理分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移陽性、腹膜轉移陽性、T3～T4期、N1期和M1期的卵巢癌組織中TTF-1及CyclinD1的陽性表達率較高（P均<0.05）；患者年齡、組織學類型與卵巢癌組織中TTF-1及CyclinD1的陽性表達率無關（P均>0.05）。病理分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移陽性、腹膜轉移陽性的卵巢癌組織LVD較高（P均< 0.05）。卵巢癌組織中TTF-1、CyclinD1陽性表達者的LVD均高于陰性表達者（P均< 0.05）。結論 TTF-1與CyclinD1在卵巢癌組織中呈現高表達。卵巢癌病情較重、出現淋巴管生成和轉移者的TTF-1和CyclinD1表達較高。TTF-1和CyclinD1可作為卵巢癌干預的潛在新靶點。

【關鍵詞】卵巢癌；甲狀腺轉錄因子1；細胞周期蛋白D1；淋巴管密度；淋巴管生成

Expression levels of TTF-1 and CyclinD1 and their relationship with lymphangiogenesis in ovarian cancer Zhang Xin， Yan Qianwen， Wang Luyi. Department of Pathology， the First Peoples Hospital of Foshan， Foshan 528000， China

Corresponding author， Zhang Xin， E-mail： 249919490@qq.com

【Abstract】Objective To investigate the expression levels of thyroid transcription factor-1 （TTF-1） and CyclinD1 in ovarian cancer and analyze their relationship with lymphangiogenesis. Methods The ovarian cancer tissue samples were collected from 60 patients with ovarian cancer and corresponding ovarian tissue samples from 20 patients pathologically diagnosed with benign ovarian tumors and normal ovarian tissue were collected as the control group. Tissue sections were prepared for immunohistochemical staining of TTF-1， CyclinD1 and D2-40. The staining results of TTF-1 and CyclinD1 were evaluated based on semi-quantitative integration method. D2-40 staining results were assessed according to Weidner evaluation method. Lymphatic vessel density （LVD） was calculated. Results The positive expression rates of TTF-1 and CyclinD1 were 58% and 83% in the ovarian cancer tissues， which were higher than 5% and 10% in the normal cancer tissues（all P < 0.001）， respectively. The positive expression rates of TTF-1 and CyclinD1 were significantly increased in the ovarian cancer tissues with pathological stageⅢ-Ⅳ， lymph node metastasis， peritoneal metastasis， T3-T4 stage， N1 stage and M1 stage （all P < 0.05）. Age and histological type were not correlated with the positive expression rates of TTF-1 and CyclinD1 （all P > 0.05）. The LVD of ovarian cancer tissues with pathological stageⅢ-Ⅳ， lymph node metastasis and peritoneal metastasis was significantly increased （all P < 0.05）. The LVD of ovarian cancer tissues with positive expression of TTF-1 and CyclinD1 was significantly higher than that of ovarian cancer tissues with negative expression （both P < 0.05）. Conclusions TTF-1

and CyclinD1 are highly expressed in ovarian cancer tissues. Patients with severe ovarian cancer， lymphangiogenesis and metastasis have high expression of TTF-1 and CyclinD1， which may be potential new targets for ovarian cancer interventions.

【Key words】Ovarian cancer； Thyroid transcription factor 1；CyclinD1；Lymphatic vessel density； Lymphangiogenesis

卵巢癌是女性生殖系統的三大惡性腫瘤之一，流行病學數據顯示我國每年新發卵巢癌患者約5.2萬例，因卵巢癌死亡的患者約2.2萬例，是病死率最高的婦科惡性腫瘤［1-2］。由于腫瘤復發和轉移以及化學治療（化療）耐藥等原因，卵巢癌的5年生存率僅約30%，許多患者在就診時已經出現了腹膜轉移［3］。因此，探索有效的基因生物標志物以幫助早期發現腫瘤轉移，對于提高治療效果、改善卵巢癌患者預后尤為重要。甲狀腺轉錄因子1（TTF-1）也稱為NKX同源框-1（NKX2-1），位于人類染色體14q13.3，是由3個外顯子和2個內含子組成的、單基因編碼的、含有一個同源結構域的轉錄因子［4］。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因定位于人染色體11q13，是細胞周期素家族中最主要的成員之一，對細胞周期起正向調控作用［5］。文獻報道，TTF-1在肺癌的發生、發展中發揮重要作用，CyclinD1則在肺癌、食管癌等惡性腫瘤中呈過表達，但關于這兩個基因對卵巢癌影響的研究很有限，作用機制尚未闡明［6-7］。本研究擬通過分析卵巢癌組織中TTF-1、CyclinD1蛋白的表達及其與臨床分期、淋巴管密度（LVD）等指標之間的關聯，探討其與臨床病理特征和淋巴管轉移間的相關性，為早期診斷卵巢癌轉移和開展治療提供參考。

材料與方法

一、標本來源

本研究的標本來自2018年1月至2020年12月在本院就診的60例卵巢癌患者，患者年齡為（48.7±9.5）歲。另收集20例經病理檢查證實的正常卵巢組織作為對照，患者年齡為（46.8±9.1）歲。2組標本來源患者的年齡比較差異無統計學意義（t = 0.780，P = 0.438）。本研究方案通過醫院倫理委員會批準（批件號：L［2022］第18號），患者均已簽署知情同意書。

二、納入與排除標準

卵巢癌患者納入標準：①年齡≥18歲；②接受手術治療，病理結果證實為卵巢癌；③手術前未經任何治療；④患者依從性佳，按期復查，隨訪資料完整。對照者納入標準：①年齡≥18歲；②因卵巢占位、子宮肌瘤、功能性子宮出血接受卵巢切除治療，病理結果證實為良性卵巢腫瘤或正常卵巢組織；③患者依從性佳，按期復查，隨訪資料完整。排除標準：①患有難以控制的糖尿病、肝腎功能不全、心血管疾病、腦血管疾病、血液系統疾病、自身免疫性疾病等全身性疾病；②孕產婦或患有其他嚴重精神或心理疾病。

三、主要試劑與材料

鼠抗人TTF-1、CyclinD1、D2-40單克隆抗體均購自北京中杉科技有限公司，辣根過氧化物酶標記IgG-HRP購自北京福盛科技有限公司，Dako REALTM免疫組織化學（免疫組化）染色試劑盒購自基因科技（上海）有限公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海金橋生物科技有限公司。

四、免疫組化染色

組織標本經10%甲醛溶液固定后，石蠟包埋，以5 μm厚進行連續切片，制備成組織切片。將切片置于烘箱內烘烤1 h后，再經脫蠟及水化，0.3% H2O2孵育30 min，PBS沖洗5 min，共3次。加檸檬酸抗原修復液，加熱10 min去除內源性過氧化物酶，自然冷卻至室溫。加入一抗（1∶100 TTF-1或1∶200 CyclinD1或1∶200 D2-40），4℃孵育過夜，PBS沖洗5 min，共3次，加入生物素標記的二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗后DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。

五、染色結果評價

由2名具有副主任醫師或以上職稱的病理科醫師基于雙盲原則對所有染色切片按半定量積分法進行評價：首先在400倍光鏡下，隨機選取10個視野分析陽性細胞百分比，視野內的陽性細胞百分比≥70%為3分，30%≤陽性細胞百分比<70%為2分，5%≤陽性細胞百分比<30%為1分，陽性細胞百分比<5%為0分；然后評價染色強度，胞漿或核膜呈棕褐色為3分，呈棕黃色為2分，呈淺黃色為1分，僅細胞核呈藍色為0分。把陽性細胞百分比評分與陽性細胞染色強度評分相加獲得總分，總分在0～3分為陰性，4～6分為陽性。

六、LVD測定

由2名具有副主任醫師或以上職稱的病理科醫師基于雙盲原則對所有切片進行評估。依據Weidner的評價方法，首先在低倍鏡下尋找腫瘤細胞周圍的D2-40陽性淋巴管密集區域（熱區），然后在200倍光鏡下，隨機選取5個視野，計數淋巴管數量，最后計算平均值，作為LVD［8］。

七、統計學處理

使用SPSS 22.0進行數據分析。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ 2檢驗或Fisher確切概率法。 P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、60例卵巢癌患者的臨床病理特征

60例卵巢癌患者中，根據國際婦產科聯盟（FIGO）手術病理分期標準Ⅰ期11例、Ⅱ期9例、Ⅲ期35例、Ⅳ期5例；根據術后病理學檢查結果，漿液性腺癌31例、黏液性腺癌17例、子宮內膜樣癌12例；高分化癌22例、低分化癌38例；淋巴結轉移陽性35例、陰性25例；腹膜轉移陽性20例、陰性40例。

二、卵巢癌組織與正常卵巢組織的TTF-1、CyclinD1和D2-40表達情況

TTF-1陽性呈棕黃色細顆粒，主要表達于細胞的胞漿及基質血管內皮內，陽性細胞呈局灶性或彌漫性分布。在60例卵巢癌組織中，TTF-1的陽性表達率為58%（35/60）；在20例正常卵巢組織中，TTF-1陽性表達率為5%（1/20），組間比較差異有統計學意義（P < 0.001）。CyclinD1陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要表達于細胞質及細胞膜，呈彌漫性分布。在60例卵巢癌組織中，CyclinD1的陽性表達率為83%（50/60）；在20例正常卵巢組織中，CyclinD1陽性表達率為10%（2/20），組間比較差異有統計學意義（P < 0.001）。D2-40陽性呈棕黃色細顆粒，在卵巢癌組織中均有表達，主要表達于淋巴內皮細胞的胞質內，無管腔的淋巴管多于有管腔淋巴管，在腫瘤細胞的細胞質中偶見D2-40表達。見圖1。

三、TTF-1、CyclinD1與卵巢癌臨床病理指標的關聯

病理分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移陽性、腹膜轉移陽性、T3～T4期、N1期和M1期的卵巢癌組織中的TTF-1及CyclinD1的陽性表達率均較高（P均< 0.05）；而與患者年齡、組織學類型無關（P均> 0.05）。見表1。

四、LVD與卵巢癌臨床病理指標的關聯

卵巢癌組織中，病理分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移陽性、腹膜轉移陽性、T3～T4期、N1期和M1期的卵巢癌組織LVD均較高（P均< 0.05）。年齡、組織學類型與卵巢癌組織LVD無關（P均> 0.05）。見表2。

五、卵巢癌組織中TTF-1、CyclinD1表達與LVD的關聯

陽性表達TTF-1、CyclinD1的卵巢癌組織中的LVD均高于陰性表達TTF-1、CyclinD1的卵巢癌組織（P均< 0.05）。見表3。

討論

作為臨床常見的婦科腫瘤之一，卵巢癌的病死率呈逐年上升趨勢，越來越受到臨床醫師的關注。從解剖學上來講，卵巢位于盆腔深部，因為疾病早期癥狀難以顯現，而且缺乏特異性的篩查指標，導致許多患者錯過了最佳治療時期［9］。此外，腫瘤細胞容易發生淋巴結轉移，使復發率較高，晚期治療預后不佳。國內外研究報道，多種細胞因子、生長因子參與了腫瘤淋巴系統轉移的調控，誘導新生淋巴管生成［10-11］。

既往研究已證實，TTF-1常表達于甲狀腺和肺起源的腫瘤，并顯示出致癌及抑癌的雙重調節功能［12］。有學者報道TTF-1可通過誘導血管生成來促進肺腺癌的進展，然而另有學者發現TTF-1對肝臟腫瘤血管生成發揮抑制作用［13-14］。美國學者進行的一項對肺癌組織的研究發現，TTF-1與淋巴結轉移密切相關，可作為肺癌淋巴結轉移的重要預測指標［15］。本研究中，TTF-1在卵巢癌組織中呈現高表達，陽性表達率為58%，并且在高級別病理分級和分期的組織中陽性表達率更高，在淋巴結轉移和腹膜轉移的組織中陽性表達率也較高，提示TTF-1是卵巢癌病情進展的促進因素。

CyclinD1是一種細胞周期調控蛋白，在正常細胞中于G1期產生，通過依賴或不依賴細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）途徑參與細胞周期G1/S轉化的調控［16］。多項研究報道，在腫瘤細胞中，翻譯后蛋白穩定等多種機制可促進CyclinD1高表達，導致致癌因子與其發生相互作用，使細胞周期紊亂，更多的細胞進入細胞增殖周期，造成失控性生長，最終引起惡性腫瘤進展［17-18］。有學者報道，CyclinD1在乳腺癌組織中的表達水平高于正常乳腺組織，并通過干預細胞增殖、侵襲和凋亡等生物學過程，促進腫瘤進展［19］。本研究顯示，CyclinD1在乳腺癌組織中的陽性表達率高達83%，且陽性表達率隨著淋巴結轉移、腹膜轉移而增加，與既往研究結果相符。

腫瘤的淋巴轉移包括淋巴浸潤、局部淋巴管擴張、新生淋巴管生成、局部淋巴結轉移和遠處淋巴結轉移等多個過程，其中以LVD升高為表現的新生淋巴管增加是促進腫瘤轉移的重要機制［20］。本研究中采用了經典的D2-40免疫組化染色來評價淋巴管數量的變化，結果顯示病理分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、腹膜轉移、T3～T4期、N1期和M1期的卵巢癌組織的LVD明顯增加，符合惡性腫瘤的淋巴轉移和進展機制。此外，陽性表達TTF-1、

CyclinD1的卵巢癌組織中LVD高于陰性組織，表明TTF-1、CyclinD1在卵巢癌的淋巴管生成和轉移過程中發揮了重要作用。

綜上所述，TTF-1與CyclinD1在卵巢癌組織中呈現為高表達，促進了卵巢癌的病情進展、淋巴管生成和轉移，可作為卵巢癌干預的潛在新靶點。TTF-1、CyclinD1在惡性腫瘤轉移過程中的作用機制還需要將來進一步深入研究，這有可能成為新型治療手段的研發方向。

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（收稿日期：2022-08-29）

（本文編輯：林燕薇）