炭基微生物菌劑促進牛糞好氧堆肥腐熟過程研究

范玉本 展恩欣 李清向 司洪宇 劉建民 王志新 梁曉輝

摘 要：為評估炭基微生物菌劑促進牛糞好氧堆肥的腐熟效果，以牛糞為原料加入自制炭基微生物菌劑進行為期34 d的堆肥試驗，并以純牛糞為空白對照，研究堆肥過程中理化指標和微生物群落的變化。結果表明，添加炭基微生物菌劑后，1 d內可使堆溫達到53 ℃，堆體最高溫度為71.7 ℃，較對照組最高溫度高出4.6 ℃，且高溫期延長3 d。至堆肥結束時，處理組和對照組的含水率、E4/E6，GI分別為29%和33%，1.5和1.9，145.5%和127.6%。通過相關性分析得出，累計溫度、含水率、pH值等理化指標相關性數值增大為67%，與細菌門水平間相關性數值增加了56%。添加0.1%（w/w）的炭基微生物菌劑可加快腐熟過程，提高微生物多樣性，加快微生物群落的演替和對物料的分解代謝，促進腐熟進程，為炭基微生物菌劑在好氧堆肥中的應用提供了理論依據。

關鍵詞：應用微生物學；炭基微生物菌劑；好氧堆肥；牛糞；腐熟；細菌群落

Study on the promotion of composting process of cow dung aerobic composting by biochar-based microbial agents

FAN Yuben1，ZHAN Enxin2，LI Qingxiang1，SI Hongyu2，LIU Jianmin3，

WANG Zhixin1， LIANG Xiaohui2

（1.School of Food Science and Biology， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei? 050018， China; 2.Energy Research Institute of Shandong Academy of Sciences， Jinan， Shandong 250014， China; 3. Shandong Huishilai Biotechnology Company Limited， Jinan， Shandong 250014， China）

Abstract：In order to evaluate the effect of biochar-based microbial agent on promoting the maturity of aerobic composting of cow dung， a composting experiment was conducted with cow dung as raw material and self-made biochar-based microbial agent for 34 days， and the changes of physical and chemical indexes and microbial communities during composting were studied with pure cow drug as blank control. The results show that after adding biochar-based microbial agents， the composting temperature could reach 53 ℃ within 1 day， and the highest composting temperature is 71.7 ℃， which is 4.6 ℃ higher than that of the control group， and the high temperature period is prolonged for 3 days. By the end of composting， the moisture content， E4/E6 and GI of treatment group and control group are 29% and 33%， 1.5 and 1.9， 145.5% and 127.6%， respectively. Through the correlation analysis， it is found that the correlation value of accumulated temperature， moisture content， pH value and other physiochemical indicators increases by 67%， and the correlation value with bacterial phylum level increases by 56%. Therefore， the addition of 0.1%（w/w） biochar-based microbial agent could accelerate the decomposition process， improve microbial diversity， accelerate the succession of microbial communities and the catabolism of materials， and promote the compost maturity process， which provides theoretical basis for the application of biochar-based microbial agents in aerobic composting.

Keywords：applied microbiology; biochar-based microbial agent; aerobic composting; cow dung; maturity; bacterial communities

好氧堆肥是畜禽糞便無害化、減量化和資源化的有效方式之一，其實質是微生物群落組成與溫度演變相對應的過程及有機質的降解^［1］。好氧堆肥時，僅依靠原料中的微生物自然發酵，其周期較長，且高溫期溫度較低或維持時間較短，導致腐熟進程緩慢。有研究表明，添加微生物菌劑可縮短堆肥周期^［2］

，提高堆肥溫度^［3］，延長高溫期^［4］，促進堆肥腐熟過程并提高堆肥效率。

炭基微生物菌劑以生物炭為載體，負載功能微生物經復配^［5］和吸附^［6］制備而成。上述2種方法，均利用生物炭具有高比表面積和豐富的多孔結構，可為微生物的生長繁殖提供適宜的棲息地，從而提高微生物群落的豐度和多樣性^［7-8］。將通過復配制備的炭基微生物菌劑用于豬糞堆肥時，可延長高溫期，提高有機質降解能力，減少NH3和N2O的排放，同時提高細菌群落的豐度和多樣性。通過吸附制備的炭基微生物菌劑，對細菌的緩釋具有一定的效果，并能延長細菌的存活時間。基于炭基微生物菌劑的以上優良特性，制備炭基微生物菌劑并應用于好氧堆肥過程中，可使外源微生物達到定殖效果，在堆肥時持續發揮作用。有研究表明，在好氧堆肥時添加生物炭和微生物菌劑可使堆體升溫更快，提高最高溫度且縮短堆肥周期^［9-11］。

目前，有關炭基微生物菌劑對好氧堆肥的作用尚無系統研究。本研究以生物炭為載體，經固態發酵制備出炭基微生物菌劑，并應用到牛糞好氧堆肥，評估炭基微生物菌劑對好氧堆肥中理化性質的影響及微生物群落的變化規律，以期為炭基微生物菌劑在好氧堆肥中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 堆肥原料

牛糞和雜草均來自濟南市長清區恒源生態農業基地，根據其基本理化性質按照3∶1進行混合，理化性質見表1。

1.1.2 微生物菌株

所用嗜熱微生物菌株為本實驗室篩選，其編號分別為X1（Geobacillus thermodenitrificans），X2（Parageobacillus toebii），SSZ（Parageobacillus toebii），JZ（Geobacillus thermodenitrificans）和YSP（Geobacillus sp.），最適生長溫度為60～80 ℃。

1.1.3 試劑

生物炭，山東環霸環保節能設備技術有限公司提供；營養肉湯等生物試劑，青島高科技工業園海博生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 液體嗜熱微生物的培養

取1.8 g營養肉湯溶于100 mL去離子水中，倒入250 mL錐形瓶中，于121 ℃滅菌20 min。將嗜熱菌X1從平板接種至無菌營養肉湯中，置于水浴恒溫振蕩器中，在65 ℃，120 r/min條件下培養20 h制成液體菌劑，嗜熱菌X2，SSZ，JZ和YSP的培養方法同上。

1.2.2 炭基微生物菌劑制備

將27 g營養肉湯溶于1 250 mL去離子水中，并與1 kg生物炭混合均勻，于121 ℃滅菌2 h，制得富營養生物炭。將1.2.1中5種液體嗜熱菌，各取50 mL加入至滅菌后富營養生物炭中，在65 ℃培養箱中進行固態發酵。每天定時攪拌2次，培養6 d。

1.2.3 堆肥試驗

試驗在濟南市長清區恒源生態農業基地進行，采用條垛式好氧堆肥，共設2個處理，每個處理堆體約4 t（長×寬×高=3.4 m×1.5 m×0.8 m），對照組不做處理，自然堆肥；處理組添加制備的的炭基微生物菌劑，接種量為0.1%（w/w），在堆肥初始階段混合均勻。前期每2 d翻堆1次，15 d后每4 d翻堆1次，堆肥時間共計34 d。

堆肥當天及每次翻堆前取樣，取樣時分別在堆體兩端及中間（1.7 m）處采集（視為3個重復），在每處不同高度（上層：0～10 cm; 中層：35～45 cm; 下層：70～80 cm）采集等量樣品，并將其混合，測定不同時期樣品的含水率、pH值、電導率（EC）、腐殖酸和黃腐酸的比值（E4/E6）、種子發芽指數（GI）及微生物群落。

1.2.4 堆肥理化指標的測定

每天上午10：00測定溫度，分別從堆體的3個不同位置測定20 cm 處的溫度，其平均值即為堆體溫度，同時測定環境溫度。含水率和EC的測定參照孟慶欣^［12］的方法。腐殖化指數E4/E6參照MOHARANA等^［13］的方法進行測定。pH值和GI按照國標《有機肥料（NY/T 525—2021）》

^［14］進行測定。

1.2.5 高通量測序

取起始階段（0 d）混合均勻的樣品，記為C1；分別取對照組和處理組高溫期（5 d）、降溫期（17 d）和腐熟期（34 d）樣品，對照組編號分別為C2，C3和C4，處理組編號分別為T2，T3和T4。將樣品送至武漢百易匯能生物科技有限公司進行高通量測序和分析。

1.2.6 數據分析和處理

采用Origin 2021 軟件進行數據分析并作圖。微生物群落分析數據由武漢百易匯能生物科技有限公司提供的云服務（https：//www.genescloud.cn/login）完成。

2 結果與討論

2.1 炭基微生物菌劑對牛糞好氧堆肥中理化指標的動態影響

2.1.1 理化指標的變化

本文研究了堆肥中溫度、含水率、pH值、EC，E4/E6和GI等理化指標的變化。由圖1? a）可知，0～3 d為升溫期，3～13 d為高溫期（≥50 ℃），13～27 d為降溫期，27～34 d為腐熟期。處理組升溫迅速，1 d內溫度達到53.0 ℃，較對照組高8.1 ℃，較環境溫度高25.0 ℃。在升溫期與高溫期，處理組與對照組的變化趨勢相同，均先升高后降低，且最高溫度都在第5 d，分別為71.7 ℃和67.1 ℃，高溫維持時間分別為13 d和10 d。13 d時處理組的累計溫度較對照組高39.1 ℃。降溫期（13～27 d）對照組溫度有所升高，處理組溫度逐漸降低。腐熟期（27～34 d），溫度均逐漸降低，接近環境溫度。至堆肥結束，處理組的累計溫度仍較對照組高9.9 ℃。高溫期（≥50 ℃）處理組（13 d）較對照組（10 d）延長3 d，而對照組在降溫期溫度回升，這可能是對照組前期有機物未完全被微生物利用，導致堆體溫度升高；而處理組前期有機物已被利用，故溫度逐漸降低。

含水率均隨堆肥過程逐漸下降（見圖1 b）），堆肥物料初始含水率為61.7%，至堆肥結束時處理組和對照組的含水率分別降至29.3%和33.0%，且堆肥過程中處理組含水率始終比對照組低3%～5%。合適的含水率是微生物生長繁殖必不可少的因素之一，50%～65%的含水率利于微生物的生長繁殖^［15］。在堆肥過程中，含水率隨堆體溫度的升高而逐漸降低，在升溫期和高溫期含水率的下降幅度最大，占總水分損失的66.3%～66.5%。研究發現，處理組水分下降幅度較對照組增加，這主要是由于炭基微生物菌劑促進溫度升高和高溫期的延長，從而使水分下降速率增加。

對照組和處理組的pH值在整個堆肥過程中變化差異不大（見圖1 c）），變化趨勢為先升高后降低，變化幅度為0.4，至堆肥結束時pH值均在8.7左右。堆肥過程中，由于溫度和水分的變化，會使氫離子濃度出現一定的變化，導致pH值發生改變。處理組和對照組的pH值變化趨勢相同，堆肥前期產生銨態氮導致pH值升高^［16］，但升溫期和高溫期由于氨氣不斷揮發、氨化作用減弱以及產生有機酸，使得pH值在17 d后緩慢下降^［17］。

圖1 d）為EC的變化，雖在升溫期有所下降，但整體呈上升趨勢，處理組始終較對照組低0.2～0.7 mS/cm，至堆肥結束時對照組和處理組的EC分別為3.6 mS/cm和2.9 mS/cm。對照組和處理組的EC變化趨勢相似。EC不僅可作為物料腐熟的標準，還可反映可溶性鹽的變化^［18］；孟慶欣^［12］使用牛糞和玉米秸稈堆肥的研究中EC變化趨勢與本文一致，均為先降低后升高。堆肥結束時，EC均小于4.0 mS/cm，達到腐熟標準^［19］，施用時不會對農作物的生長產生抑制作用。

由圖1 e）可知，對照組和處理組的E4/E6在升溫期變化不大，高溫期逐漸增大，即腐殖酸（humic acid，HA）含量增加，黃腐酸（fulvic acid，FA）含量下降，致使芳構化程度增大。降溫期E4/E6大幅度下降，在腐熟期趨于平緩。至堆肥結束，對照組和處理組的E4/E6分別為1.9和1.5。E4/E6不僅反映堆肥過程中腐殖質的縮合度和芳構化程度，還是判斷腐熟度的重要指標，E4/E6的比值越低，腐殖質縮合度和芳構化程度越高^［4］，并隨腐殖酸縮合度的增大而減小。在堆肥進程中，大分子腐殖酸形成使E4/E6的比值趨于降低^［20］，該結果與MOHARANA等^［13］的研究結果一致。添加炭基微生物菌劑能夠促進腐殖酸的形成，同時可提高腐熟度。

GI的變化如圖1 f）所示，其趨勢為先降低后逐漸升高，且二者的變化趨勢相同。經過高溫期，處理組和對照組的GI分別為109.7%和81.9%。在降溫期和腐熟期，處理組和對照組的GI仍緩慢上升，當堆肥結束時GI分別達到145.5%和127.6%。GI是評估堆肥產品腐熟度和植物毒性大小的指標^［21］。堆肥初期產生的有機酸和酚類等物質，會抑制種子萌發^［22］。一般認為，GI在80%時達到腐熟標準^［23］。經過高溫期，處理組GI為109.7%，對照組為81.9%；至堆肥結束，處理組和對照組的GI分別高出腐熟標準65.5%和47.6%。結果表明，添加炭基微生物菌劑后，僅經過高溫期即可使GI超過腐熟標準，比對照組高出28%，大幅提高了物料的腐熟度。

2.1.2 理化指標的綜合分析

為綜合分析處理組與對照組間理化指標的差異，將堆肥過程中累計溫度、含水率、pH值、EC，E4/E6和GI結合堆肥4階段進行主成分分析，對照組和處理組的雙標圖（載荷圖和分值圖）分別如圖2 a）和圖2 c）所示，其中 圖2 b）和圖2 d）分別為其局部放大圖。對照組和處理組中理化指標間Pearson相關性如圖3 a）和圖3 b）所示。

由圖2 a）和圖2 b）中載荷圖的變化可知，處理組在加入炭基微生物菌劑后，EC和E4/E6與累計溫度、含水率、pH值、GI等理化指標間的相關性發生變化；圖3理化指標間Pearson相關性結果表明，EC和累計溫度、含水率、E4/E6的相關性值均增大，E4/E6與pH值、GI的相關性值均增大。同時，EC和pH值、E4/E6與含水率與的相關性由負相關變為正相關，E4/E6與累計溫度間由正相關變為負相關。此外，對比處理組和對照組間Pearson相關性得出，EC和含水率的相關性由顯著（P≤0.05）變為極顯著（P≤0.01），含水率與GI間由不顯著變為顯著（P≤0.05）。對照組中累計溫度與含水率間為負相關，處理組加入炭基微生物菌劑后，二者相關性未發生變化；通過圖3可進一步看出，對照組和處理組中累計溫度與含水率間均是極顯著負相關（P≤0.05）。由Pearson相關性分析可知，上述理化指標間15個相關性中，相關性增加的占比為66.7%，減少的占比為20.0%，相關性改變的占比為13.3%。

從圖2 b）和圖2 d）中分值圖的變化可知，處理組堆肥過程中樣品的分布較對照組均勻，且同一階段樣品的分值較為緊湊，表明樣品間相似性高，不同階段間界限明顯（P≤0.05）。同時，處理組升溫階段和高溫階段的樣品均在各95%置信橢圓內，同一階段樣品間距離較短，相似性較高；不同階段樣品間距離較遠，組間有較好的區分度。

單獨分析處理組和對照組的溫度、含水率和pH值等理化指標時，只能對單一指標進行分析，得出的結論不夠全面，不能綜合分析出炭基微生物菌劑對理化指標間的影響；而由主成分分析和Pearson相關性分析，可準確得到理化指標間的變化趨勢及結果。研究結果表明，加入炭基微生物菌劑后，E4/E6和EC與其他理化指標間的相關性發生明顯改變（P≤0.05），這與LI等^［24］在雞糞堆肥中添加微生物菌劑的分析結果一致。同時，累計溫度、pH值、EC、含水率、GI與pH值、EC，GI，E4/E6和pH值、EC的相關性有所增加。Pearson相關性分析表明，在理化指標間的15個相關性中，相關性增加的占比為66.7%。上述變化產生的原因可能是炭基微生物菌劑使堆體溫度迅速上升，有利于嗜熱菌在高溫期的大量定殖^［2］。同時，溫度是決定堆肥效率的關鍵^［26］，炭基微生物菌劑可使堆溫升高、延長高溫期，加速含水率的下降，使pH值和EC發生變化，腐殖化指數E4/E6的比值降低，提高GI，縮短堆肥周期，提高了生物轉化效率，促進堆肥腐熟進程。

2.2 炭基微生物菌劑對牛糞好氧堆肥中細菌群落的影響

2.2.1 細菌群落的多樣性分析

樣品中細菌群落的Alpha多樣性結果如表2所示。

由表2可知，樣品中細菌群落的Coverage指數均在0.99以上，即樣品中99%以上的微生物均被檢測到，能較為真實地反映各階段樣品的微生物群落。通過Chao1指數和Shanon指數的變化可知，對照組和處理組細菌群落的豐度和多樣性整體變化趨勢均為先增加后減少，但對照組腐熟期C4的豐度和多樣性均較降溫期C3有所提高。此外，處理組降溫期T3的豐度和多樣性間變化趨勢不同，豐度較高溫期T2增加，多樣性卻減少。同時，腐熟期T4的豐度較降溫期T3減小了55.5%，但多樣性僅減少6.6%。

細菌群落的Beta多樣性，采用Bray-Curtis距離算法，在95%置信區間得出結果，如圖4所示。隨著堆肥過程的進行，從起始階段C1至腐熟期T4，處理組不同時期樣品的細菌群落間有明顯變化（P≤0.05）。對照組在高溫期C2變化明顯（P≤0.05），而降溫期C3和腐熟期C4無明顯差異（P>0.05），即群落組成相似。此外，對照組和處理組在高溫期、腐熟期的直線距離最近，即C2和T2，C4和T4樣本間群落組成差異較小。

2.2.2 細菌群落門水平的影響

細菌群落在門水平的分布如表3所示，從起始樣C1至高溫期C2，對照組中厚壁菌門（Firmicutes）增幅為7.2%，而高溫期T2中厚壁菌門（Firmicutes）較高溫期C2的豐度高出4.9%；Firmicutes的豐度變化在降溫期更明顯，T3比C3提高32.3%。高溫期，C2中微生物豐度較T2高的種群主要是脫球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）和擬桿菌門（Bacteroidetes），分別高出4.7%和1.6%。而降溫期，T3中僅Firmicutes豐度較C3高。至腐熟期，T4中變形菌門（Proteobacteria）和Bacteroidetes的豐度分別比C4分別高出23.6%和0.43%。上述變化表明，炭基微生物菌劑主要在高溫期和降溫期促進Firmicutes的增殖，并在腐熟期促進Proteobacteria微生物的生長，使Proteobacteria和放線菌門（Actinobacteria）在群落中發揮主導作用。

2.2.3 細菌群落門水平與理化指標的Pearson相關性分析

細菌群落門水平的豐度與溫度、含水率、pH值、EC，E4/E6和GI的Pearson相關性如圖5所示。由圖5 b）可知，處理組門水平細菌群落（厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、Chloroflexi、棲熱球菌門和擬桿菌門）與理化指標（溫度、含水率、pH值、EC，E4/E6和GI）間36個相關性中，相關性增加的占比為55.6%，減少的為22.2%，相關性發生改變的是13.9%，8.3%的相關性數值未變化。加入炭基微生物菌劑后，Firmicutes與EC，E4/E6和GI間的相關性明顯增加。

研究堆肥過程中細菌群落和豐度的變化，有助于更加全面地分析腐熟過程。檢測不同時期樣品的細菌群落，通過Alpha和Beta多樣性分析，可把7個樣品分為4類，分別為C2和T2；C3，C4和T4；C1和T3各為一類。添加炭基微生物菌劑后，高溫期與對照組的差別不大，但降溫期有明顯差異（P≤0.05），腐熟期則無明顯差異（P>0.05），Alpha和Beta多樣性的變化趨勢與張晶等^［26］和黃雅楠等^［27］的研究結果相一致。對細菌群落門水平的分析表明，Firmicutes在高溫期T2比C2的豐度提高4.9%，降溫期T3較C3的豐度高出32.3%。Firmicutes在堆肥過程中對纖維素降解和轉化起主要作用^［28］，經過高溫期，一些不耐熱的微生物處于死亡或休眠狀態^［29］，而生物炭比表面積大、孔隙率高等特點，使炭基微生物菌劑的定殖效率提高，從而加速了雜草中纖維素的降解和轉化。此外，炭基微生物菌劑的加入，影響了堆肥中微生物群落的分布與演替，如Deinococcus-Thermus、Bacteroidetes和

Proteobacteria等。炭基微生物菌劑可促使細菌門水平與理化指標間36個相關性發生較大改變，相關性數值增加的占比為55.6%。添加炭基微生物菌劑后，可增加細菌群落的多樣性，促使各種微生物對物料的分解代謝，進而促進堆肥腐熟的進程。

3 結 語

添加炭基微生物菌劑，可使牛糞好氧堆肥快速升溫，提高最高溫度，延長高溫期，且E4/E6，EC與累計溫度、含水率、GI，pH值等理化指標的相關性顯著改變（P≤0.05），Pearson相關性分析理化指標間15個相關性時，相關性增加的占比為66.7%。炭基微生物菌劑所屬Firmicutes豐度在高溫期和降溫期均有所提高，尤其在降溫期可提高32.3%，同時對其他群落的豐度和演替也有一定影響，使理化指標與細菌門水平間相關性系數增加到55.6%。研究表明，在牛糞好氧堆肥時，加入炭基微生物菌劑可明顯提高理化指標間相關性的數值，加速微生物群落的演替，增加細菌群落的多樣性，對物料進行分解，促進堆肥腐熟進程，提高堆肥產品質量。

鑒于炭基微生物菌劑可迅速提高堆體溫度、延長高溫期、加速微生物群落演替等優點，今后還應對炭基微生物菌劑在堆肥中是否可減少NH3，N2O，CO2等氣體的排放進行深入的研究，更加全面地揭示炭基微生物菌劑在堆肥中的作用效果。

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