大口黑鱸源鰻弧菌的分離鑒定

李媛媛，蔡 琰，張連英，孫金輝，包海巖，徐曉麗，3

(1.天津農學院，天津 300191；2.天津市水產研究所，天津 300221；3.全國水產技術推廣總站，中國水產學會，北京 100125)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)也稱加州鱸，原產于北美洲密西西比河流域，20世紀70年代末由我國臺灣地區引入，人工繁育成功后，引入廣東開始養殖[1-3]。由于其具有生長迅速，抗逆性強，容易起捕，且肉質鮮美，營養豐富，無肌間刺等特點受到養殖者及消費者的青睞，目前在全國二十余個省、市、自治區均有養殖，其中以廣東、福建大口黑鱸養殖業較為成熟，已形成苗種繁育、成魚養殖、飼料供應、產品加工等較為完善的產業鏈[4-5]。鑒于大口黑鱸在淡水養殖魚類中市場需求大、價格相對較高且穩定，養殖效益較好，近年來也成為北方地區鹽堿水池塘養殖中最受青睞的名優魚類品種。在市場需求的帶動下，產量逐年上升，養殖從業者為追求高效益，普遍采用高密度養殖模式，水質管理與調控難度加大，細菌、病毒、寄生蟲等病害高發，已報道的引起大口黑鱸疾病的病原包括大口黑鱸虹彩病毒(Largemouth bass virus，LMBV)、大口黑鱸彈狀病毒(Micropterussalmoidesrhabdovirus，MSRV)、柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcohumnare)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、鰤魚諾卡氏菌(Nocardiaseriolae)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)以及括車輪蟲(Trichodina)、斜管蟲(Chilodonella)、日本鯴(Argulusjaponicus)等[1-3，5-9]。大口黑鱸病害在造成巨大的經濟損失的同時，也易誘發水產品質量安全問題，嚴重阻礙產業健康發展。

2020年4月，天津市靜海區某養殖場養殖的大口黑鱸出現以體表及肝臟出血為主要特征的疾病，病魚短時間內出現大量死亡。為明確其病因，本研究取患病大口黑鱸進行病原分離，獲得1株優勢菌，人工感染實驗確定其致病性，病原菌經生理生化特性、16S rRNA基因序列分析、特異性基因檢測，鑒定其為鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，同時采用藥敏紙片法篩選了病原敏感藥物，以期為大口黑鱸鰻弧菌病的診斷和防治提供參考。

1 材料方法

1.1 實驗材料

患病大口黑鱸采自天津靜海區某養殖場，發病池塘為大口黑鱸精養池塘，每667 m2投放魚種3 000尾。發病魚體長25～30 cm，體表有明顯的出血，發病池塘水溫19.2 ℃，鹽度2.2，pH為8.6。健康大口黑鱸取自天津藍科水產養殖有限公司，體長(7±1)cm，體質量(4.0±0.4)g，暫養在75 L水族箱中，使用充氣泵進行增氧，每日投餌2次，吸污1次，實驗過程中養殖水溫維持在20 ℃左右。

營養瓊脂、腦心浸液(BHI)培養基、細菌生化鑒定管、藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。PCR產物回收采用生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式DNA膠回收試劑盒進行。

1.2 病原菌分離

取體表明顯出血的瀕死大口黑鱸，酒精消毒體表后無菌條件下進行解剖，觀察病魚內臟變化，采用灼燒后的接種環從病魚肝、脾、腎處取少許組織，劃線接種在BHI平板培養基上；28 ℃下培養24 h，篩選形態一致的優勢菌落經進一步純化培養，得到純培養菌株并編碼為2004301，保種待用。

1.3 人工感染實驗

將健康大口黑鱸飼養在45 L玻璃缸內，分為7組，每組20尾，其中實驗組6缸，分別注射不同濃度的菌株2004301的菌懸液，1缸為對照組。將菌株2004301于BHI液體培養基中培養20 h，以無菌含0.85% NaCl的生理鹽水洗滌3次，調整菌懸液濃度為3×108、3×107、3×106、3×105、3×104、3×103cfu/mL，從大口黑鱸胸鰭下方注射入魚腹腔，每尾注射100 μL，對照組注射相同量的生理鹽水。注射后對實驗魚進行持續觀察，每日正常投喂、換水吸污并記錄大口黑鱸的發病及死亡情況，取人工感染發病的瀕死大口黑鱸再次分離、純化細菌。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 生理生化鑒定

將菌株2004301劃線接種于營養瓊脂培養基，28 ℃培養24 h，觀察菌落特征，制作細菌滴片，革蘭氏染色后觀察細菌形態。應用法國生物梅里埃(biomerieux)公司的VITEK2 GN鑒定卡進行，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[10]進行細菌其他理化特性鑒定。

1.4.2 分子生物學鑒定

取純培養的菌株2004301，懸浮于無菌蒸餾水中，沸水浴3 min，快速冷卻后離心取上清為PCR反應模板。

菌株2004301的16S rRNA基因、hsp60基因序列擴增參照文獻[2，11]中方法進行，擴增產物回收后由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。特異性基因檢測參照秦蕾等[12]、孫晶晶等[13]的方法進行。

向Gene Bank數據庫分別提交菌株2004301的16S rRNA基因、hsp60基因序列，經NCBI 的Blast 檢索系統進行同源性分析，篩選出同源性較高的菌株的基因序列并使用Clustal x 1.83軟件比對。分別以16S rRNA基因、hsp60基因作為分子標記，使用系統發育分析軟件Mega 5.2，根據鄰接法(Neighbor-joining，NJ法)構建系統發育樹，并利用Bootstraps檢測置信度，自舉數集1 000次。

1.5 藥物敏感實驗

用藥敏紙片法檢測菌株2004301對32種藥物的敏感性，調整菌懸液濃度為0.5個麥氏比濁度，吸取100 μL菌液均勻涂布在MH平板培養基上，將藥敏紙片用無菌鑷子均勻貼在平板培養基表面，在28 ℃培養箱內培養24 h，記錄每片藥敏紙片的抑菌圈直徑，并根據藥敏紙片抑菌范圍說明標準對實驗結果進行判斷。

2 結果

2.1 病原菌分離

發病大口黑鱸以體表出血為主要癥狀，病魚活力差、不食，爛鰓，體表變黑，有不同程度的充血出血，鱗片脫落，以鰓蓋下緣、胸鰭基部、腹鰭基部、腹部最為明顯(圖1a)。解剖可見脾臟腫大，肝臟充血發紅(圖1b)。鏡檢未發現寄生蟲。

圖1 病魚典型癥狀Fig.1 Symptoms of diseased M.salmoides.

從病魚肝脾腎均分離得到大量形態一致的菌落，純化后編碼2004301，在BHI固體培養基上培養24 h形成邊緣光滑整齊、較扁平、不透明的、淺橘黃色的圓形菌落，在TCBS培養基上形成黃色菌落。菌體革蘭氏染色陰性，稍彎曲短桿狀，菌體長約1～2 μm，散在或成對存在，液體培養基中呈均勻渾濁生長，無莢膜，無芽孢(圖2)。

圖2 菌株2004301的菌體形態Fig.2 Cell morphology of strain 2004301

2.2 病原致病性分析

采用腹腔注射方式驗證菌株2004301的致病性，分別以不同濃度的純培養的菌懸液感染健康大口黑鱸，菌株2004301表現出較強的致病性。感染第2天，注射濃度為3×108、3×107cfu/mL的兩組實驗魚全部死亡，無明顯癥狀；注射濃度為3×106cfu/mL的實驗魚死亡率為60%(圖3)；實驗組魚不食，獨游，活動減弱，第5天注射濃度為3×105cfu/mL組死亡的實驗魚開始出現體表充血癥狀，解剖發現肝臟充血。從實驗組瀕死魚中肝臟處再次進行細菌分離，得到大量菌落形態與菌株2004301一致的單菌落，革蘭氏染色顯示菌體形態亦與菌株2004301一致。對照組無任何癥狀，無一死亡。人工回歸感染結果說明，菌株2004301是導致本次大口黑鱸發病死亡的病原菌。根據實驗魚的死亡結果(表1)，按照改進寇氏法[14]計算菌株2004301對大口黑鱸(4 g)的半數致死量為5.3×104cfu/mL。依據SANTOS等[15]對魚類致病菌毒力的劃分標準，可以判斷菌株2004301具有較強毒力。

表1 菌株2004301的人工感染實驗結果Tab.1 The results of artificial infection of strain 2004301

圖3 菌株2004301人工感染實驗結果Fig.3 The results of the infecion experiments of 2004301 strain

2.3 病原生理生化鑒定結果

菌株2004301可運動，氧化酶與接觸酶陽性，發酵型，硝酸鹽還原陽性，VITEK2 GN鑒定卡未鑒定出該菌。綜合菌株2004301生理生化特性鑒定結果，與鰻弧菌較為一致(見表2)，初步判定菌株2004301為鰻弧菌。

表2 菌株2004301和鰻弧菌的生理生化特征的比較Tab.2 Comparison of physiological and chemical characteristics of strain 2004301 and V.anguillarum

2.4 病原的分子生物學鑒定

采用細菌通用引物B27F和1492R擴增菌株2004301的16S rRNA基因，獲得約1 500 bp的基因片段，上傳至Gene bank數據庫，登錄號為OP389068。NCBI序列比對結果表明，菌株2004301與鰻弧菌(GQ205444.1、MH507181.1)的16S rRNA基因序列高度一致，基于NJ法構建的系統發育樹結果顯示，菌株2004301與鰻弧菌(GQ205444.1、MH50718.1、KF460456.1)聚為一支(圖4)。

圖4 基于16S rRNA基因構建的鰻弧菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of V.anguillarum based on 16S rRNA gene

為更準確地確定該菌的分類地位，采用引物(HSP60-P1：ACAACAGCAACGGTACTAGC；HSP60-P2：CAACTTTCACGATGCCAC)擴增該菌的hsp60基因，得到預期的約540 bp的目的片段(圖5)，測序序列上傳至Gene bank數據庫，登錄號為OP422534，與Gen bank中已提交的弧菌hsp60基因序列進行比對分析，并構建2004301基于hsp60的系統發育樹，結果顯示2004301與鰻弧菌(CP023310.1、CP022468.1、AF230932.1、AM162559.1、CP022101.1、KV360391.1)聚為一支，置信度為100%(圖6)。綜合2004301的16S rRNA基因和hsp60的系統發育分析結果，結合菌株的形態及生理生化特性，鑒定菌株2004301為鰻弧菌。

圖5 菌株2004301 hsp 60基因的擴增及PCR鑒定結果Fig.5 The results of strain 2004301 hsp 60 amplification and PCR identificationM：Marker DL2000；1，6：陰性對照；2：菌株2004301 tox R基因擴增；3：鰻弧菌tox R基因擴增；4：菌株2004301 emp A基因擴增；5：鰻弧菌emp A基因擴增；7：菌株2004301 hsp 60基因擴增。

圖6 基于hsp 60基因構建的鰻弧菌系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of V.anguillarum based on hsp 60 gene

采用鰻弧菌引物angF(正向引物序列為5′-CACCAACGAGCCTGAAGA-3′)和angR(5′-GGAGAGCCAGAATAGGTAAGAA-3′)擴增菌株2004301的toxR基因，得到預期大小為206 bp的堿基片段；利用鰻弧菌特異性引物對菌株2004301的empA基因進行擴增，獲得了預期大小為248 bp的基因片段，見圖5。進一步證實菌株2004301為鰻弧菌。

2.5 藥敏實驗

表3結果顯示，菌株2004301對恩諾沙星、氟苯尼考、磺胺甲惡唑、鏈霉素、慶大霉素、氧氟沙星及環丙沙星敏感，對強力霉素、土霉素、萬古霉素及頭孢類藥物不敏感，對強力霉素、痢特靈、四環素、諾氟沙星等中度敏感。

表3 菌株2004301的藥物敏感性結果Tab.3 The results of sensitivity test to strain 2004301

3 討論

鰻利斯頓氏菌也稱鰻弧菌，是水產養殖動物的最常見的病原菌，1893年首次從“紅疫”病的鰻鱺中分離到，1909年BERGEMAN首次命名為鰻弧菌。1985年由MACDONELL和COLWELL建議該菌由弧菌屬歸入利斯頓氏菌屬，命名鰻利斯頓氏菌[16]。2011年THOMPSON等[17]利用多種分子生物學技術分析該菌基因組特征，提議將該菌恢復原先的分類，認為利斯頓氏菌屬是弧菌屬的同物異名，鰻利斯頓氏菌即為鰻弧菌，這一觀點也得到了認可[18-20]，故本研究采用鰻弧菌這一名稱。作為歐洲現有記錄中最早的魚類病原菌，經過漫長的選擇進化，鰻弧菌的宿主范圍越來越廣，致病性及環境適應性逐漸增強，現已知能夠感染50多種海淡水養殖動物如半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大口黑鱸以及中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、牡蠣(Ostreidae)等，導致“弧菌病”，發病迅速，流行范圍廣，死亡率高，給養殖者造成巨大經濟損失[21-22]。本次首次從養殖大口黑鱸體內分離到鰻弧菌，人工感染實驗顯示其半數致死量為5.3×104cfu/mL，具有較強毒力，為本次大口黑鱸病害的致病菌，進一步說明鰻弧菌的宿主廣泛性及強致病性。

能夠引起魚類出現體表出血充血癥狀的病原較多，如諾卡氏菌(Nocardiaseriolae)，維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、多種弧菌、鰻弧菌等[2，8，13-14]，本研究菌株2004301生化特性對照伯杰氏細菌鑒定手冊及已有報道中鰻弧菌的生化特性，發現菌株2004301與鰻弧菌較為一致，但VITEK2 GN鑒定卡未鑒定出該菌，分析可能為鑒定卡中培養液成分不適于該菌生長或鑒定卡對應的數據庫中收錄的該菌生化特性數據不全面。16S rRNA及hsp60為分子標記構建的系統發育樹，均將菌株2004301與鰻利斯頓氏菌及鰻弧菌聚為一支，進一步驗證了THOMPSON等[17]的觀點，鰻弧菌即為鰻利斯頓氏菌；同時，以hsp60為分子標記的系統發育樹，準確地將同種弧菌聚為一支，證實了hsp60基因可用作弧菌屬細菌的種間分類。采用鰻弧菌toxR基因及empA基因的特異性引物也擴增得到預期大小的目的基因片段，證實菌株2004301即為鰻弧菌。

生產上對鰻弧菌引起的病害，主要的治療措施仍為使用抗菌藥物。在對鰻弧菌的藥物敏感性研究方面，郭睿[23]從斜帶髭鯛(Hapalogenysnitens)上分離的鰻利斯頓氏菌藥物敏感性結果顯示，該菌株對新生霉素、左氟沙星、奧氟沙星、氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、羅紅霉素等7種藥物敏感，對四環素、利福平、強力霉素、氨芐西林等8種抗生素耐藥；王庚申等[24]對養殖許氏平鲉中分離到的鰻利斯頓氏菌藥敏篩選結果顯示，該菌株對克拉霉素、氟羅沙星、萘啶酸、新生霉素、頭孢唑肟等抗生素藥物高度敏感，對紅霉素、復方新諾明、阿奇霉素等藥物中度敏感；對青霉素、頭孢唑林、頭孢拉定等多種藥物具有抗性；姚學良等[22]從豹紋鰓棘鱸體內分離到的鰻利斯頓氏菌對48種抗生素的敏感性結果顯示，對紅霉素、強力霉素、四環素、頭孢類等25種藥物敏感，對恩諾沙星、羅紅霉素、痢特靈等22種藥物不敏感。本研究中菌株2004301對32種抗菌藥物的敏感性實驗結果表明，所分離到的菌株2004301對頭孢類、萬古霉素、強力霉素、新霉素、苯唑西林、氨芐西林、麥迪霉素、卡那霉素等17種藥物耐藥，對四環素、復合磺胺、呋喃唑酮等7種藥物中度敏感，對沙星類藥物、氟苯尼考等7種藥物較為敏感，其耐藥譜進一步擴大，提示對該菌進行耐藥性監測及耐藥基因研究的必要性。鑒于鰻弧菌不同分離株的藥物敏感性差異，本研究結果僅可作為用藥及耐藥規律研究的參考，精準用藥還應建立在對每次發病病原菌的分離及藥敏實驗基礎之上。