三種投入品對克氏原螯蝦抗氧化酶、丙二醛、磷酸酶和溶菌酶的影響

王 寧，鄭 堯，，劉祝萍，張鳳翔，孔繁彬，孟順龍，陳家長，

(1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214128；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業農村部稻漁綜合種養生態重點實驗室，江蘇無錫 214081；3.興化市現代農業發展服務中心，江蘇興化 225700；4.興化市香湖糧食種植家庭農場，江蘇興化 225700)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)又名小龍蝦，也稱為紅螯蝦和淡水小龍蝦，是我國重要的淡水經濟蝦類，其風味獨特，肉質鮮美且營養價值高[1]，隨著其種群的擴展和養殖活動的增加，在長江中、下游地區，已形成可供利用的龐大種群[2]。在克氏原螯蝦養殖過程中，養殖戶常使用硫酸銅和青苔凈殺滅因投料過多以及使用水質改良劑產生的藍藻及青苔。在其他水產品養殖過程中硫酸銅應用也比較廣泛，但存在過量使用的情況，且面源殘留的銅離子也會流入養殖水體，造成銅離子超標[3]。興化蝦蟹混養模式在江蘇等省份廣泛推廣，該模式主要特點是收集和定量放養抱仔蝦[4]，期間養殖戶為了管理方便，常使用草甘膦去除塘邊雜草，部分草甘膦便隨地表徑流流入池塘導致克氏原螯蝦面臨染毒風險。

肝胰腺是甲殼動物消化、吸收、儲存和代謝功能的重要器官[5]，環境脅迫會導致肝胰腺中抗氧化酶活力和其他相關酶活力的變化，研究表明銅離子對鯉(Cyprinuscarpio)[3]、麥穗魚(Pseudorasboraparva)[6]、銀鮭(Oncorhynchuskisutch)[7]、泥魚(Labeocapensis)和大口黑鱸(Micropterussalmoides)[8]等魚類造成肝胰臟急性毒性，青苔凈進入動物體后會引起繼發性溶血反應[9]，草甘膦對水生動物也具有一定的毒性[10，11]，但實驗中的投入品濃度是否會影響克氏原螯蝦肝胰臟毒性不得而知。本研究旨在探究三種常用投入品對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化酶、丙二醛、磷酸酶和溶菌酶活性的影響，為克氏原螯蝦健康養殖提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設計

實驗蝦體長(81.69±3.65)mm，體質量(21.31±2.07)g，取自興化市香湖糧食種植家庭農場，實驗室中暫養7 d后，挑選體格健壯、健康的克氏原螯蝦置于玻璃缸(63 cm×43 cm×45 cm)中，注入15 L曝氣自來水，暫養以及實驗過程中水溫控制在(18.5±2.3)℃，pH為7.5±0.6，溶解氧為(8.6±2.9)mg/L，正常投餌，每日光暗比12 h ∶12 h。

硫酸銅(優級純)購自國藥集團，青苔凈[主要成分二甲戊樂靈(Pendimethalin)含量40%]購自中水漁藥有限公司，草甘膦(有效成分草甘膦含量為30%，草甘膦異丙胺鹽含量41%)購自澳大利亞拜迪斯有限公司。

參考實際生產中使用濃度設置對照、CuSO4(1和2 mg/L，分別記為CuⅠ、CuⅡ組)、青苔凈(5和10 μg/L，分別記為PⅠ、PⅡ組)、草甘膦(5 μg/L和10 μg/L，分別記為GⅠ、GⅡ組)，每組設置三個平行，每個平行10只個體。實驗期間正常投餌，采用半靜水式養殖方法，不間斷微量充氧，暴露期間每24 h換水1/3并補足藥物，分別于第4、8和12 d于冰上采集克氏原螯蝦的肝胰腺，取出后放置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 酶活性測定方法

準確稱取待測組織的質量，按質量(g)∶體積(mL)=1 ∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，用電動研磨器充分研磨后，在冷凍離心機(2 500 r/min，4 ℃)離心10 min，取上清液(10%組織勻漿液)，放入2 mL離心管中，待測。

蛋白定量(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、還原型谷胱甘肽(GSH)、總抗氧化能力(T-AOC))、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所,測定步驟按試劑盒進行。其中,TP、SOD、CAT、MDA的測定分別采用托馬斯亮藍法、WST-1法測定、鉬酸鹽法、TBA法。

1.3 統計分析

用Microsoft Excel 2019進行數據統計與分析，采用SPSS 26.0進行統計描述，多個樣本均數采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以Duncan法進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義，繪圖采用OriginPro 2018。

2 結果與分析

2.1 三種投入品對克氏原螯蝦抗氧化酶活性的影響

在整個實驗暴露期間，6個實驗組的SOD、CAT和GPX活性均表現出先升高后降低的變化趨勢(圖1a，圖1b，圖1f)，8 d時實驗組顯著高于對照組。CuⅠ實驗組GR活性表現出持續升高的變化趨勢(圖1c)，8 d時實驗組顯著高于對照組，而其他實驗組則表現出先上升后降低的變化趨勢(圖1)。6個實驗組的GSH活性表現出先升高后降低的變化趨勢(圖1d)，4 d時實驗組顯著低于對照組。6個實驗組的T-AOC活性表現出持續降低的變化趨勢(圖1e)，4 d時實驗組顯著高于對照組。8 d時實驗組的SOD、CAT、GR和GPX活性均顯著高于對照組且實驗組的SOD、CAT、GSH和GPX活性在8 d時達到最大值；T-AOC活性在4 d時達到最大值，隨后逐漸降低。

圖1 三種投入品對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of three inputs on the activity of antioxidant enzymes in the hepatopancreas of P.clarkii處理組與對照組之間存在顯著差異用不同小寫字母表示(P<0.05)，下同。

2.2 三種投入品對克氏原螯蝦MDA含量的影響

整個實驗暴露期間，CuⅠ、CuⅡ、PⅠ、PⅡ、GⅡ組MDA含量表現出先降低后升高的變化趨勢(圖2)，GⅠ實驗組MDA含量表現出持續升高的變化趨勢(圖2)，12 d時，實驗組MDA含量顯著高于對照組，青苔凈和草甘膦暴露下MDA含量在12 d時達到最大。

圖2 三種投入品對克氏原螯蝦肝胰腺MDA含量的影響Fig.2 Effects of three inputs on MDA content in P.clarkii hepatopancreas

2.3 三種投入品對克氏原螯蝦ACP和AKP活性的影響

整個實驗暴露期間，CuⅠ、PⅠ、GⅠ、GⅡ實驗組ACP活性表現出先降低后升高的變化趨勢(圖3a)，CuⅡ、PⅡ實驗組ACP活性表現出持續上升的變化趨勢(圖3a)。 CuⅠ、CuⅡ、PⅠ、PⅡ濃度組AKP活性表現出先下降后上升的變化趨勢(圖3b)，GⅠ、GⅡ濃度組AKP活性表現出持續上升的變化趨勢(圖3b)，6個實驗組12 d時ACP活性達到最大值。

圖3 三種投入品對克氏原螯蝦肝胰腺磷酸酶(ACP和AKP)活性的影響Fig.3 Effects of three inputs on the activity of hepatopancreatic phosphatase(ACP and AKP)in P.clarkii

2.4 三種投入品對克氏原螯蝦LZM活性的影響

整個實驗暴露期間，CuⅠ、CuⅡ、GⅠ、GⅡ實驗組LZM活力表現出先上升后下降的變化趨勢(圖4)，PⅠ、PⅡ實驗組LZM活力表現出持續下降的變化趨勢，8 d時，實驗組LZM活性均高于對照組。

圖4 三種投入品對克氏原螯蝦肝胰腺LZM活性的影響Fig.4 Effects of three inputs on LZM activity of P.clarkii hepatopancreas

3 討論

3.1 三種投入品對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化酶活性的影響

T-AOC的大小反映了機體抗氧化酶系統和非酶系統對外來刺激的代償能力以及自由基的代謝狀態[22]，可以反映機體的抗氧化能力。本研究結果也表明，當機體內與抗氧化相關的酶活性升高時，T-AOC的活性也出現了提升。投入品長時間作用下會引起機體的代償失調、抗氧化酶系統遭到破壞[23]，進而導致機體損傷。本研究表明，克氏原螯蝦在本實驗濃度投入品毒性下抗氧化酶類活性受到影響，12 d時抗氧化相關酶均有不同程度的降低，但若長時間處于相應環境下，可能因超過自由基清除能力進而對抗氧化酶系統造成損傷。

3.2 三種投入品對克氏原螯蝦肝胰腺MDA含量的影響

脂質過氧化之后的主要產物是MDA，MDA含量可直接反映生物體內脂質過氧化的強弱[24]，間接反映氧化損傷的程度，MDA能降低細胞膜的通透性與流動性[25]，其含量隨機體的氧化應激水平的升高而增加[26]，且含量越高表明機體遭受損傷的程度越大。含污染物化工區溪流水體中斑馬魚肝臟MDA含量隨著暴露時間的延長表現出先下降后上升的變化趨勢[27]，實驗中4～8 d時，Cu Ⅰ、Cu Ⅱ、P Ⅰ、P Ⅱ、G Ⅱ處理組CAT活性處于升高趨勢，MDA含量出現降低，這是由于CAT可以抑制MDA的生成；8～12 d，CAT活性降低，此時實驗中各濃度組MDA含量表現出上升趨勢，并在12 d時除CuⅡ濃度組外均達到最大值，宋玥頤[15]也發現0.1、0.5和1 mg/L氟苯蟲酰胺處理斑馬魚14 d后，斑馬魚肝臟MDA含量顯著增加，這與本實驗吻合。

3.3 三種投入品對克氏原螯蝦肝胰腺磷酸酶(ACP、AKP)和LZM活性的影響

ACP、AKP和LZM是參與生物體生長代謝、保持內環境穩定及維持機體健康所必需的酶，對生物體的免疫作用具有重要意義。王麗梅等[28]發現0.83、4.15和20.77 mg/L環氧丙烷處理刺參(Stichopusjaponicus)48和72 h后其體腔液AKP、ACP活性增強，彭軍輝等[29]證實擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)體內ACP和AKP活性隨氨氮脅迫時間的增加而升高，沈敏等[30]發現高鹽脅迫下凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)體內ACP活性升高，酸性磷酸酶(ACP)是溶酶體的一種標志酶，主要參與細胞內蛋白質的消化和吸收。其中ACP會在生物體血淋巴免疫反應中被釋放，對入侵物質進行吞噬和包圍[31]，AKP參與生物體營養物質如脂質、糖類、鈣和無機磷酸鹽的吸收[32]，AKP能提高生物對體內物質的攝取轉運和清除異物能力[33]。實驗中ACP和AKP活性總體上表現為上升趨勢，表明外來物質增多或機體內物質的降解速度升高，需要ACP和AKP活性的增高來應對這種變化。溶菌酶來自單核細胞、中性粒細胞，是一種具有抗菌能力的水解酶，能使細菌破裂，可以在一定程度上反映魚類非特異性體液免疫狀態，是非常重要的非特異性免疫評價指標之一。張瑞標等[34]發現在飼料中添加沼澤紅假單胞菌后，皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)LZM活性呈現先升高后降低的趨勢，這與本實驗CuⅠ、CuⅡ、GⅠ、GⅡ濃度組的變化趨勢是一致的，LZM活力下降可能是長時間的投入品脅迫導致克氏原螯蝦肝胰腺內生理紊亂，導致其免疫功能降低，從而LZM活力下降。

4 結論

(1)三種投入品擾亂克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化酶系統，造成脂質過氧化水平升高。

(2)克氏原螯蝦肝胰腺SOD、CAT、GPX、GSH活性先被誘導后抑制減弱，處理后期ACP和AKP活性均被誘導；青苔凈和草甘膦暴露下GR活性先被誘導后抑制減弱；MDA含量顯著增加；硫酸銅和草甘膦暴露下，LZM活性先被誘導后抑制減弱。