大黃素納米載藥系統逆轉人膽囊癌細胞上皮-間充質轉化的可行性研究

達選博，張誠，項雨凱，胡海，何川崎，孔祥余，邱晨，呂貝寧，張紅雷，王玉彬，楊玉龍

（同濟大學附屬東方醫院 膽石中心，上海 200120）

大量研究證明中空介孔硅（HMSNs）具有許多吸引人的特性，例如良好的生物相容性、孔體積大、可控釋放行為（存在于介孔殼中的通道）和高負載效率（大的空心核），作為藥物載體顯示出巨大的潛力[1-3]。大黃素（Emodin，EMO）是一種很有前途的天然物質，以其抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌功能而聞名[4-5]，該化合物是從掌葉大黃、大黃等中草藥中分離得到的，但是其低生物利用度，限制了EMO的應用。本研究通過制備負載大黃素的中空介孔硅載藥微粒（EMOHMSNs），在體外實驗中探討人膽囊癌細胞（NOZ）對載藥微粒的攝取效率以及逆轉其上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的能力，構建一個更好地傳遞大黃素的系統。

1 材料和方法

1.1 材料

NOZ來自于上海交通大學附屬瑞金醫院肝膽外科劉穎斌團隊贈與。氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，≥98%），十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，98%），正硅酸四乙酯（TEOS），乙醇（ethanol，分析純），濃鹽酸（37% HCl），濃氨水（37%～38% NH3·H2O）購自國藥集團；BCA試劑盒，異硫氰酸熒光素（FITC，≥90%）購自上海碧云天生物技術研究所；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；轉化生長因子β1（TGF-β1）購自美國Selleck公司；EMO購自MCE公司。

1.2 EMO-HMSNs的制備與表征

以實心二氧化硅（sSiO2）納米顆粒為硬球模板，選擇性地刻蝕去除硬球模板，進而得到HMSNs。（1）用St?ber法[6]合成sSiO2納米顆粒：100 mL乙醇、8 mL水和4 mL濃氨水混合后加入3 mL TEOS，在30 ℃水浴條件下攪拌6 h。（2）形成介孔硅（mSiO2）包被sSiO2的核殼結構（sSiO2@mSiO2）納米顆粒：混合220 mL水、10 mL乙醇和1 200 mg CTAB，把上一步得到的sSiO2納米顆粒加入混合液中，攪拌30 min后，加入1.0 mL TEOS，30 ℃水浴條件下過夜。（3）將上述溶液離心，分散到150 mL濃度為0.4 mol/L的Na2CO3溶液中，在50 ℃條件下反應2 h[7]，反應結束后離心，在超聲的協助下用HCl/Ethanol[8-9]溶液和水分別洗三次，即可得到HMSNs。

加入0.5 mL濃度為2 mg/mL的FITC乙醇溶液，在避光條件下搖床上室溫反應24 h制備FITCHMSNs。將EMO溶解在20 mL HMSNs無水乙醇中超聲30 min，然后攪拌過夜，離心，水洗除去游離的藥物EMO，凍干后使用。

掃描電子顯微鏡（SEM）觀察HMSNs的表觀形態和粒徑大??；透射電子顯微鏡（TEM）觀察HMSNs的表觀形態和孔道結構；動態光散射（DLS）測定HMSNs電勢和粒徑大??；紫外分光光度計定量EMO-HMSNs載藥率、包封率。用紫外分光光度計測定吸光度，以EMO濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制出EMO的標準曲線。

1.3 NOZ的培養

DMEM培養基（10%胎牛血清）常規培養，溫度37 ℃、5% CO2，飽和濕度。

1.4 CCK8實驗檢測細胞存活率

以5.0×103/孔的密度接種NOZ細胞于96 孔板，實驗組細胞用不同濃度的HMSNs（0、50、150、300、500 μg/mL）處理，24 h后加入CCK8 溶液10 μL/孔，繼續孵育1 h后，酶聯免疫檢測儀上以波長450 nm測各孔吸光度（OA）值，計算細胞存活率。

1.5 細胞攝取實驗檢測納米粒子在細胞內的分布

取細胞爬玻片置于24孔細胞培養板內，將對數生長期細胞NOZ細胞系接種于24 孔板中（500 μL，2×105個/mL），置于恒溫培養箱中過夜，加入1 mL濃度為20 μg/mL HMSNs-FITC納米顆粒溶液，分別孵育不同時間（1、6 h）后，用Hoescht 33342 和Dil（細胞膜紅色熒光探針）分別染細胞核和細胞膜后，4%多聚甲醛固定，封片，用激光共聚焦顯微鏡檢測納米粒子在細胞內的分布。

1.6 流式細胞儀檢測細胞內納米顆粒的熒光強度

將對數生長期NOZ細胞以106個/mL密度接種于細胞培養6 孔板中，加入1 mL濃度為20 μg/mL HMSNs-FITC納米粒溶液，分別孵育不同時間（1、6 h）后，將細胞重懸于500 μL的PBS溶液中上機檢測。

1.7 Transwell實驗檢測細胞的遷移性

將2.0×105個NOZ細胞接種于小室上室面，下室加入完全培養基，待細胞貼壁后將上下室培養液換成TGF-β1，TGF-β1+EMO，TGF-β1+EMOHMSNs的完全培養基分別作用24 h后取出，用棉簽輕輕擦掉上室細胞，于4%多聚甲醛中固定，1%結晶紫染色，倒置顯微鏡下200倍觀察細胞，每個樣本隨機取10個視野取均值。

1.8 Western blotting檢測相關蛋白表達水平

NOZ細胞經過TGF-β1，TGF-β1+EMO，TGFβ1+EMO-HMSNs處理24 h后，收集細胞，提取總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測E-cadherin、Ncadherin、Vimentin蛋白濃度。蛋白上樣量為40 μg，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。孵育一抗、二抗后化學發光成像儀獲取圖片。

1.9 統計學分析

采用IBM SPSS 22.0軟件進行統計學分析，均表示為（）。兩組間比較用t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EMO-HMSNs的表征結果

用三步法制備了單分散的HMSNs。SEM結果表明，HMSNs粒徑均一，直徑約為100 nm（圖1A）；TEM結果表明HMSNs為球形結構，具有較大空腔（圖1B）。DLS表明納米粒子的粒徑約為201 nm、表面電位（zeta電位）27.29 mV，如圖1C和D所示。紫外分光光度計定量EMO-HMSNs載藥率（48.53±1.25）%，包封率（20.12±0.23）%，穩定性良好。

圖1 HMSNs形貌表征

2.2 生物安全性評價

利用CCK8試劑盒對HMSNs的細胞毒性進行檢測。NOZ細胞系分別與不同濃度的HMSNs共孵育24 h，NOZ細胞在HMSNs 500 μg/mL的高濃度下存活率超過85%，表明HMSN納米粒子對后續的實驗研究不會產生影響，實驗結果如圖2所示。

圖2 與不同濃度的HMSNs共孵育24 h后NOZ細胞的存活率，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 體外細胞攝取HMSNs

激光共聚焦顯微鏡觀察NOZ細胞攝取HMSNs，結果表明NOZ細胞可以攝取HMSNs，并且隨著時間的延長，攝取的HMSNs會增多，6 h后細胞內熒光強度明顯強于1 h。如圖3A所示。流式檢測結果與激光共聚焦顯微鏡觀察結果一致，并對NOZ細胞攝取HMSNs進行量化對比。如圖3B所示，NOZ細胞攝取HMSNs隨時間延長而增多。

2.4 細胞的遷移性

Transwell實驗觀察細胞遷移性改變：空白對照組為（5.20±0.55）個，TGF-β1 組為（30.56±2.32）個，TGF-β1+EMO組為（23.27±1.67）個，TGF-β1+EMO-HMSNs組為（11.50±0.65）個。與空白對照組比較，TGF-β1組細胞數目明顯增多（P＜0.001）；與TGF-β1組和TGF-β1+EMO組比較，TGF-β1+EMOHMSNs組細胞數目減少最為顯著（P＜0.001）。結果表明大黃素載藥微粒對膽囊癌NOZ細胞的遷移能力有顯著抑制作用。見圖4。

圖4 各組對NOZ細胞遷移能力的影響（×200）

2.5 EMT相關蛋白表達水平的影響

各組作用NOZ細胞48 h后，分別對E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達水平進行單獨比較后結果顯示，其E-cadherin蛋白表達水平在TGF-β1+EMO-HMSNs組與Control組、TGF-β1組、TGF-β1+EMO組比較有差異有統計學意義（P＜0.05）；其Ncadherin蛋白表達水平在TGF-β1+EMO-HMSNs組與TGF-β1組、TGF-β1+EMO組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其Vimentin蛋白表達水平在TGF-β1+EMO-HMSNs組與Control組、TGF-β1組、TGF-β1+EMO組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。N-cadherin在TGF-β1組與空白對照組比較差異均有統計學意義（P=0.0046）。結果表明TGF-β1通過TGFβ-Smad通路作用于下游相關因子N-cadherin、E-cadherin、Vimentin，使其在蛋白水平呈相應變化，而這種促進蛋白表達水平變化的作用能夠被EMO-HMSNs顯著抑制。見圖5。

圖5 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達水平

3 討論

EMO作為一種植物化學物質，由于其多靶點活性和缺乏實質性毒性，在癌癥治療中發揮著特殊作用。EMO可通過下調β-catenin和Vimentin的活性，上調E-cadherin的表達水平，從而抑制癌細胞的遷移和侵襲能力[10-12]。此外有研究報道，EMO可能通過阻斷Wnt通路預防EMT以及具有抗血管生成和抗轉移作用的可能分子機制[13]。但是，EMO的藥代動力學參數較差，嚴重影響其生物利用度和生物活性，限制了其在臨床中的應用。

為了克服人體中天然化合物的低生物利用度和EMO疏水性限制。納米藥物載體如納米粒子、納米纖維、納米傳遞體和納米乳液已經被研究用于藥物遞送[14-16]。HMSNs是一種良好的的藥物遞送載體系統，具備良好的生物可降解性和大孔體積[17]。在本研究中我們成功制備了粒徑均一、具有中空結構的HMSNs，其具備良好的生物相容性和膽囊癌被動靶向性，構建了一個更好地遞送EMO的系統。

安全有效和細胞攝取是載藥納米遞送系統發揮靶向作用和治療作用的基石。CCK8 實驗表明納米顆粒具有良好的生物安全性。采用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀評估了NOZ細胞中HMSNs的攝取，結果顯示隨著時間延長，細胞內納米顆粒積累增多。以上結果表明本研究制備的納米顆粒可以進行下一步的體外細胞實驗。

Transwell實驗結果及Western blotting研究結果顯示，經納米載藥顆粒處理48 h后，EMO被載藥微粒成功遞送膽囊癌細胞并進入細胞質中，顯示出良好的抑制膽囊癌細胞EMT的效用。相較于EMO，EMO-HMSNs由于其納米級別的微小性質以及中空結構，常規體積下能夠負載更多的EMO，能克服EMO疏水性限制，抗腫瘤作用顯著高于游離EMO，可作為良好的藥物載體。

總之，本研究建立了一種新的納米遞送系統，名為EMO-HMSNs，可有效解決EMO疏水性問題，通過胞吞作用進入細胞質釋放藥物，顯著抑制膽囊癌細胞的遷移能力，但其潛在的腫瘤局部給藥體內試驗尚有待進一步研究。