2015-2019年上海某院致瀉性大腸埃希菌流行與耐藥特征*

施怡茹,郁 晞,盧曉蕓,馬樹文,龔 羲,徐秋芳

上海市青浦區疾病預防控制中心微生物檢驗科,上海 201700

致瀉性大腸埃希菌(DEC)主要引起人類感染性腹瀉和食物中毒,是眾多國家和地區夏秋季引起腹瀉的主要病原菌之一。既往研究報道伊朗中部和印度北部DEC檢出率分別為13.91%、29.00%[1-2];在國內多省市,DEC均為引起感染性腹瀉的前3位細菌[3-5]。根據攜帶的毒力基因、致病機制和流行病學特征,DEC可分為腸產毒性大腸埃希菌(ETEC)、腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸集聚性大腸埃希菌(EAEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希菌[EHEC或產志賀毒素大腸埃希菌(STEC)]及彌散黏附性大腸埃希菌(DAEC)[6]。近年來,DEC對青霉素類、頭孢菌素類和喹諾酮類等常用抗菌藥物出現了較高的耐藥率,耐藥監測數據顯示我國多地區DEC多重耐藥(MDR)率為50%以上[7]。為進一步了解上海市青浦區DEC耐藥情況,本研究收集青浦區2015-2019年腹瀉門診患者肛拭子標本中分離的DEC,以微量肉湯稀釋法測定其最小抑菌濃度(MIC),分析其抗菌藥物敏感性,結合人口社會學信息進行統計學分析,為轄區DEC引起感染性腹瀉和相關耐藥的防控工作提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015-2019年上海市青浦區腹瀉病監測定點醫院上海復旦大學附屬中山醫院青浦分院(以下簡稱本院)腹瀉門診收治的疑似細菌性腹瀉初診患者為研究對象。患者納入標準:癥狀以腹瀉為主,次數≥3次/天,糞便性狀異常,為稀便、水樣便、黏液便或膿血便等。

1.2儀器與試劑 Vitek 2 Compact全自動微生物檢測系統。Vitek 2 GN生化鑒定板條(法國,BIOMERIEUX);ETEC、EHEC、EIEC、EAEC、DAEC、EPEC核酸檢測試劑盒[熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)法,上海之江生物科技股份有限公司];麥康凱瓊脂(MAC)平板、O157顯色平板、腸道綜合發酵管A+B(上海科瑪嘉微生物技術有限公司);mEC肉湯(青島海博生物技術有限公司);Cary-Blairt培養基、革蘭陰性需氧菌藥物敏感性檢測板[型號B-3、B-4,上海復星高科技(集團)有限公司]。所有試劑均在有效期內使用。

1.3方法

1.3.1標本采集 由腹瀉門診按照《上海市腹瀉病監測實施方案(2014年試行版)》采集符合要求的腹瀉患者肛拭子標本,保存于Cary-Blair培養基,采樣后2 h內送檢。根據患者采樣信息,所有患者口述就診前未服用抗菌藥物。

1.3.2菌株分離鑒定和收集 按照《上海市腹瀉病監測實施方案(2014年試行版)》實驗室檢驗部分的標準操作規程,將收到的肛拭子標本劃線接種到MAC平板上,36 ℃培養24 h,若分離菌株疑似為EHEC(O157∶H7),用mEC肉湯增菌后,劃線接種于O157顯色平板上,36 ℃培養24 h;挑取可疑菌落進行初步生化試驗,采用熒光定量PCR(循環參數:37 ℃×2 min;94 ℃×2 min;93 ℃×15 s,60 ℃×60 s,循環40次;于60 ℃熒光檢測)在Vitek 2 Compact全自動微生物檢測系統上進行確證。所有DEC菌株均由上海市疾病預防控制中心病原檢定所復核鑒定。收集2015-2019年分離鑒定的DEC菌株,于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3微量肉湯稀釋法檢測藥物敏感性 采用微量肉湯稀釋法,以商品化藥物敏感性檢測板檢測菌株對12類26種常用抗菌藥物[氨芐西林(AMP)、氨芐西林-舒巴坦(SAM)、四環氧普林(TET)、氯霉素(CHL)、復方磺胺甲噁唑(SXT)、頭孢咪唑(CFZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢西丁(CFX)、慶大霉素(GEN)、亞胺培南(IMI)、萘啶酸(NAL)、磺胺異噁唑(Sul)、環丙沙星(CIP)、阿莫西林-克拉維酸(AMC)、多黏菌素E(CT)、多黏菌素B(PB)、米諾環素(MIN)、阿米卡星(AMI)、氨曲南(AZM)、頭孢吡肟(FEP)、美羅培南(MEM)、左氧氟沙星(LEV)、多西環素(DOX)、卡那霉素(KAN)、鏈霉素(STR)]和2種超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)抑制劑[頭孢噻肟-克拉維酸(CTX-C)、頭孢他啶-克拉維酸(CAZ-C)]的MIC值,按照試劑盒說明書進行試驗操作,根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)發布的M100 S31文件中的藥物敏感性折點進行結果判定。質控菌株采用大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.4統計學處理 采用Excel 2010軟件整理數據,采用SPSS25.0統計軟件進行統計分析。計數資料以例數或百分率表示,采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1DEC檢出情況 2015-2019年共收到本院腹瀉門診送檢的肛拭子標本6 772份,其中4 494份符合本研究納入標準,513份肛拭子標本檢出1種DEC分型,標本陽性率和DEC檢出率均為11.42%,分別為339株ETEC(66.08%)、97株EPEC(18.91%)、74株EAEC(14.42%)、1株EHEC(0.19%,2017年3月發病、女性、學生)和2株EIEC(0.39%,2015年9月發病、男性、工人)。發病高峰集中于第3季度。陽性患者集中于19～<36歲年齡段,以工人為主。各年度DEC檢出率比較,差異有統計學意義(χ2= 24.570,P<0.001)。見表1。

表1 2015-2019年青浦區DEC檢出情況[n或n(%)]

年度(年)n季度第1季度第2季度第3季度第4季度毒力分型EAECEHECEIECETECEPEC合計20159780757251120591789(9.10)20161 48011313915270010338168(11.35)201769411397413018318115(16.57)2018592111463130039961(10.30)20197501145781000551580(10.67)合計4 49445839655741233997513(11.42)χ2111.390-24.570P<0.001-<0.001

2.2DEC耐藥情況與流行變遷 分離的DEC菌株中,500株完成26種(12類)常用抗菌藥物和2種ESBLs抑制劑的藥物敏感性試驗。2015-2019年DEC至少對1種抗菌藥物耐藥的耐藥率分別為89.89%、83.23%、93.86%、96.72%和90.67%,差異有統計學意義(χ2=12.650,P=0.013),不存在線性相關(P=0.077),線性彌合趨勢見圖1。

DEC對抗菌藥物的耐藥率以NAL最高(60.20%),其他依次為AMP(57.80%)、SXT(31.40%)、Sul(30.20%)、TET(27.60%)、CFZ(22.20%),對其余22種抗菌藥物的耐藥率均未超過20.0%。各種抗菌藥物耐藥情況逐年變化,其中CTX-C、GEN、STR、TET、SXT、Sul和AMP這7種抗菌藥物各年度的耐藥率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。各毒力分型DEC對不同抗菌藥物的耐藥率不同,ETEC對11種抗菌藥物的耐藥率明顯低于EPEC和EAEC,對NAL的耐藥率高于EAEC、EPEC,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

注:①為至少對1種抗菌藥物耐藥;②為MDR,即對3類或3類以上抗菌藥物耐藥。

2.3MDR情況 500株DEC的MDR率為46.40%(232/500),其中EAEC為75.00%(54/72),EPEC為58.95%(56/95),ETEC為36.97%(122/330),差異有統計學意義(χ2=41.446,P<0.001)。2015-2019年MDR率分別為40.45%(36/89)、51.55%(83/161)、40.35%(46/114)、47.54%(29/61)、50.67%(38/75),差異無統計學意義(χ2=5.244,P=0.263),不存在線性相關(P=0.518),線性彌合趨勢見圖1。

2.4ESBLs檢出和碳青霉烯類耐藥情況 500株DEC菌株中52株為產ESBLs菌株,檢出率為10.40%,其中10株對CTX-C均耐藥。2015-2019年DEC菌株中ESBLs檢出率分別為12.36%(11/89)、3.11%(5/161)、19.30%(22/114)、11.48%(7/61)、9.33%(7/75),差異有統計學意義(χ2=19.414,P<0.001);EAEC、EPEC和ETEC中的ESBLs檢出率分別為6.94%(5/72)、7.37%(7/95)、12.12%(40/330),差異無統計學意義(χ2=2.891,P=0.236)。對檢出碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株3株,均為EAEC。

2.5人口社會學特征與耐藥 不同職業、戶籍患者的MDR率、ESBLs檢出率比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 2015-2019年青浦區DEC的耐藥情況(%)

續表2 2015-2019年青浦區DEC的耐藥情況(%)

表3 不同人口社會學特征患者分離DEC菌株的MDR和ESBLs檢出情況

3 討 論

DEC的耐藥問題日趨嚴峻,已成為治療臨床感染的嚴重威脅。既往研究報道伊朗中部地區和越南胡志明市腹瀉患者分離的DEC的MDR率分別高達78.13%和71.84%[1,8]。安徽地區、武漢同濟醫院及上海地區檢出DEC的MDR率分別為54.76%、66.67%和65.44%[7,9-10]。

2015-2019 年上海青浦區腹瀉病定點監測醫院腹瀉門診患者的DEC檢出率(11.42%)略高于上海市檢出率(5.81%)[4]和全國檢出率(7.70%)[11]。陽性患者集中于19～<36歲人群,以工人為主。青浦區DEC檢出率略高于上海市檢出率,可能與青浦區的外來人口主要以工人為主,而工人的飲食衛生習慣、意識和經濟水平相對較低。2017年的DEC檢出率明顯高于其余4年,可能因為就診患者中工人占比大,且2017年工人群體中DEC檢出率增加從而影響總體檢出率。

對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥或產ESBLs的DEC是世界衛生組織首份抗菌藥物耐藥“重點病原體”清單中一員[12]。2020年全國細菌耐藥監測網數據顯示,上海地區DEC對碳青霉烯類、第3代頭孢菌素類等多種主要抗菌藥物耐藥率均超過全國平均水平[13],應給予高度重視。

2015-2019年DEC的耐藥率總體呈上升趨勢,各年度差異有統計學意義(P<0.05),以NAL耐藥最為嚴重,其次為AMP、Sul、SXT等。各抗菌藥物中僅CTX-C、GEN、STR、TET、SXT、Sul和AMP這7種抗菌藥物在各年度的耐藥率比較中差異有統計學意義(P<0.05)。2015-2019年MDR情況嚴峻,各年度MDR率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。研究結果顯示青浦區DEC對CTX耐藥率遠低于安徽[7]、杭州[3]等地區,但腸桿菌屬對第3代頭孢菌素和NAL經誘導易產生耐藥性[14],其嚴峻的耐藥現狀和趨勢仍需引起重視。

2015-2019年青浦區腹瀉門診檢出產ESBLs菌株52株(10.40%),高于福建省腹瀉門診(4.54%)[15],遠低于杭州市腹瀉門診(29.41%)[3]。對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株3株,均為EAEC,產ESBLs是DEC對第3代頭孢菌素類藥物耐藥的重要機制[16]。需引起醫院和耐藥防控的重點關注。

各毒力分型DEC對不同抗菌藥物產生了不同程度的耐藥。ETEC對11種抗菌藥物的耐藥率明顯低于EAEC、EPEC,對NAL的耐藥率高于EAEC、EPEC,差異均有統計學意義(P<0.05),與文獻[1,3,7-10]報道一致,僅EAEC毒力分型對CAZ耐藥。病原菌耐藥性主要由抗菌藥物失活、藥物外排泵、降低對抗菌藥物的滲透性和抗菌藥物靶點改變這4類耐藥機制產生[17],對各種抗菌藥物耐藥由相應的耐藥基因編碼,故可考慮不同毒力分型DEC對各種抗菌藥物的耐藥差異可能與不同分型菌株會攜帶、介導不同耐藥機制的基因或耐藥基因有關。

人口社會學特征分析中,MDR率隨年齡增長而升高,但差異無統計學意義(P>0.05);不同職業、戶籍患者的MDR率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。其中農民MDR率最高(80.00%),經分析農民群體75%為60歲以上人群,除年齡原因外,還可能與其耐藥意識和醫囑服從性較差有關;其次為離退休人員(53.66%,高齡人群),符合各研究中年齡越大,MDR越嚴重的結論[1,3,18]。外來流動人口的MDR率和ESBLs攜帶率均高于本地常住人口,差異有統計學意義(P<0.05),可能與醫療機構的用藥習慣和規范程度有關,或可能與本地常住人口的用藥醫囑服從性相對較好有關[19-20]。

本研究分析了上海市青浦區DEC的流行特征和耐藥情況,為DEC引起的腹瀉疫情防控和臨床藥物的規范使用提供合理建議和參考,為進一步研究該地區DEC耐藥機制提供基礎數據。本研究數據僅來源于青浦城區唯一一家三級綜合性醫院,就診患者可能相對集中于青浦城區和東片區居民,但該醫院為青浦區唯一一家市級腹瀉病監測定點醫院,服務面覆蓋全轄區,能夠相對充分地反映轄區的DEC流行和耐藥分布情況。《上海市腹瀉病監測實施方案(2014年試行)》未要求青浦區腹瀉病監測定點醫院開展5歲以下兒童腹瀉監測,且2015-2019年標本來源患者中僅5例為5歲及以下兒童,故不納入研究。后期應完善社區腸道門診監測或增加定點醫院,以健全青浦區DEC耐藥譜,加強規范用藥指導。