熱性驚厥患兒血清miR-148a-3p HMGB1 25（OH）D水平與癲癇發作的相關性

張義堂 秦小菀 石 巖 侯海燕 殷 雪 李 哲 徐會民 劉麥葉 李萬楨 宋春雨

南陽市中心醫院，河南 南陽 473000

熱性驚厥在呼吸道感染嬰幼兒中較為常見，尤其是6個月至5歲的患兒，發病率為2%～5%。由于嬰幼兒體溫調節中樞發育不完善，易高熱發生驚厥，導致神經系統功能紊亂［1-2］。熱性驚厥頻繁發作可能遺留神經系統后遺癥，最常見的表現為癲癇發作［3-4］。近年來，分子標志物與熱性驚厥的研究較為熱門，微小RNA（microRNA，miR）是一種小分子的內源性非編碼RNA，在血液中非常穩定，不容易降解，這種特性使得miR 十分適合作為疾病的診斷標志物。有研究發現血清miR-148a-3p 高水平與熱性驚厥密切相關［5］，但尚未有研究分析miR-148a-3p 對熱性驚厥繼發癲癇的預測價值［6-7］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種神經體質炎癥介質，目前研究發現炎癥反應在熱性驚厥及癲癇發作中具有重要作用，HMGB1表達過量增加兒童癲癇發病風險［8-9］，不過HMGB1對于熱性驚厥繼發的癲癇是否也產生影響尚未可知。研究證實維生素D缺乏與兒童癲癇密切相關［10］，維生素D具有神經穩定作用，但熱性驚厥患兒繼發癲癇是否與維生素D 缺乏有關，國內鮮有報道，血清25-羥維生素D（25 hydroxyvitamin D，25（OH）D）能否作為熱性驚厥繼發癲癇的標志物值得分析。本研究探討熱性驚厥患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平與預后癲癇發作的相關性，分析各項指標對熱性驚厥繼發癲癇的預測價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性分析2018-01—2022-03 南陽市中心醫院收治的122 例熱性驚厥患兒。納入標準：（1）符合熱性驚厥的診斷標準［11］，肛溫≥38 ℃伴隨驚厥發作；（2）首次確診的熱性驚厥；（3）年齡≤5周歲；（4）病歷資料齊全。排除標準：（1）既往有癲癇病史；（2）合并先天性、遺傳性疾病；（3）腦外傷、腦出血、腦發育畸形、缺血缺氧性腦病、顱內感染等；（4）心血管疾病、肝腎疾病、血液病、營養不良、代謝性疾病、惡性腫瘤等。根據熱性驚厥患兒預后結局是否發生癲癇，分為熱性驚厥癲癇組36 例和熱性驚厥非癲癇組86 例。小兒癲癇的診斷標準［12］：有明確的癲癇發作癥狀，腦電圖異常放電為診斷金標準，結合磁共振檢查可確診。同期選擇55例未發生驚厥的呼吸道感染僅發熱的患兒為對照組。對照組患兒符合急性上呼吸道感染的診斷標準，肛溫≥38 ℃，未發生驚厥，年齡≤5周歲，排除其他任何疾病。3組患兒一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 3組患兒一般資料比較Table 1 Comparison of general data among three groups of children

1.2 檢測方法所有患兒入院時采集外周靜脈血，3 500 r/min離心分離血清。

1.2.1 血清miR-148a-3p 檢測：geneMAG-RNA/DNA試劑盒（美國Chemicell 公司）。將樣本與RNA 抽提劑以體積1∶1.5 的比例混合，再加入氯仿混合均勻，4 ℃下離心得到上層清液。將上層清液轉移至另一離心管中，得到捕獲有miR-148a-3p 的磁珠。加入5 mol/L硫氰酸胝緩沖液混合均勻，加入不含RNA酶的無核酸酶洗脫液，60～70 ℃水浴，從磁珠上洗脫捕獲的miR-148a-3p。室溫條件下離心，得到含有miR-148a-3p的樣本，置于—80 ℃冰箱保存備用。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應，試劑盒購自美國ABI 公司。反應體系：100 mmol/L dNTPs 0.15 μL、Multiscribe反轉錄酶1 μL，10×反轉錄緩沖液1.5 μL，RNA 抑制劑0.19 μL，反轉錄引物2 μL，含微小RNA的提取樣品2 μL，無核酸酶的水8.2 μL，反應體系15 μL/管。反應程序：16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃5min，4 ℃保存。miR-148a-3p熒光定量聚合酶鏈式反應，TaqMan 2*Universal PCR Master Mix 10 μL，Nuclease-free water 7 μL，Primer probe l μL，反轉錄產物2 μL，反應體系20 μL/管，2 次重復。反應程序：50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s循環40 次。參照說明書采用2-ΔΔCt法計算miR-148a-3p 的相對表達量。

1.2.2 血清HMGB1 檢測：采用酶聯免疫吸附法檢測，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。檢測儀器為800TS 酶標儀（美國BioTek 公司），嚴格按照試劑盒說明操作。

1.2.3 血清25（OH）D檢測：采用化學發光法檢測，試劑盒購自上海紀寧生物有限公司，檢測儀器為180SE全自動化學發光儀（拜耳公司），嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3 資料收集方法查閱患兒病歷，收集下列資料：性別、月齡、肛溫、身高、體質量、驚厥類型、高熱持續時間、驚厥持續時間、癲癇家族史、是否早產、是否低出生體質量、是否有圍生期窒息史、退熱后腦電圖結果。

1.4 統計學方法使用SPSS 22.0統計分析軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，3組比較采用方差分析。計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。多因素分析采用Logistic 回歸分析。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）、靈敏度、特異度以及最佳截斷值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平比較熱性驚厥癲癇組的血清miR-148a-3p表達量高于熱性驚厥非癲癇組、對照組（P＜0.05），并且熱性驚厥非癲癇組的血清miR-148a-3p 表達量高于對照組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組的血清HMGB1 水平高于熱性驚厥非癲癇組、對照組（P＜0.05），且熱性驚厥非癲癇組的血清HMGB1水平高于對照組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組的血清25（OH）D水平低于熱性驚厥非癲癇組、對照組（P＜0.05），且熱性驚厥非癲癇組的血清25（OH）D水平低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D水平比較 （±s）Table 2 Comparison of serum miR-148a-3p, HMGB1, and 25（OH）D levels among three groups of children （±s）

表2 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D水平比較 （±s）Table 2 Comparison of serum miR-148a-3p, HMGB1, and 25（OH）D levels among three groups of children （±s）

注：miR-148a-3p為微小RNA-148a-3p；HMGB1為高遷移率族蛋白B1；25（OH）D為25-羥維生素D；與對照組比較，①P＜0.05；與熱性驚厥非癲癇組比較，②P＜0.05

組別熱性驚厥癲癇組熱性驚厥非癲癇組對照組F值P值n 36 86 55 miR-148a-3p 2.26±0.57①②1.71±0.43①1.50±0.38 32.248＜0.001 HMGB1（μg/L）7.45±1.87①②6.70±1.58①5.33±1.29 22.603＜0.001 25（OH）D（μg/L）26.83±6.79①②34.24±8.56①42.16±4.15 52.224＜0.001

2.2 熱性驚厥導致癲癇發作的單因素分析熱性驚厥癲癇組與熱性驚厥非癲癇組驚厥類型、高熱持續時間、驚厥持續時間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結果比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒復雜性熱性驚厥的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒高熱持續時間≥24 h 的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒驚厥持續時間≥15 min的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒有癲癇家族史的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒腦電圖異常的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。2組患兒早產兒、低出生體質量兒、圍生期窒息史比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 熱性驚厥導致癲癇發作的單因素分析 ［n（%）］Table 3 Single factor analysis of epilepsy caused by febrile convulsion ［n（%）］

2.3 熱性驚厥導致癲癇發作的多因素logistic 回歸分析以癲癇發作為因變量，以單因素分析中有統計學意義的因素：驚厥類型、高熱持續時間、驚厥持續時間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結果、miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 為自變量，進行Logistic回歸分析。賦值：癲癇發作：是=1，否=0；驚厥類型：復雜性=1，單純性=0；高熱持續時間≥24 h=1，＜24 h=0；驚厥持續時間≥15min=1，＜15min=0；癲癇家族史：是=1，否=0；退熱后腦電圖結果：異常=1，正常=0。結果顯示，驚厥類型、驚厥持續時間、退熱后腦電圖結果、miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D與癲癇發作存在相關關系（P＜0.05），見表4。

表4 熱性驚厥導致癲癇發作的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of epilepsy caused by febrile convulsion

2.4 血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 預測熱性驚厥患兒癲癇發作的ROC 曲線分析ROC 曲線顯示，血清miR-148a-3p 截斷值為1.93（AUC=0.850，95% CI：0.777～0.924），血清HMGB1 截斷值為7.00 μg/L（AUC=0.802，95% CI：0.720～0.884），血清25（OH）D 截斷值為30.85 μg/L（AUC=0.703，95%CI：0.599～0.808），對熱性驚厥患兒癲癇發作的預測效能最高，靈敏度和特異度分別見表5。ROC曲線見圖1。

圖1 miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 預測熱性驚厥患兒癲癇發作的ROC曲線Figure 1 ROC curves of miR-148a-3p，HMGB1，25（OH）D predicting epilepsy in children with febrile convulsion

表5 血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D預測熱性驚厥患兒癲癇發作的ROC曲線分析Table 5 Analysis of ROC curves of serum miR-148a-3p，HMGB1，25（OH）D predicting epilepsy in children with febrile convulsion

3 討論

熱性驚厥是嬰幼兒常見疾病，絕大部分患兒預后良好，但仍有少部分患兒最終進展為癲癇［13］。文獻報道［14］，既往有過熱性驚厥病史的嬰幼兒日后發生癲癇的患病率遠高于無熱性驚厥病史的嬰幼兒。熱性驚厥導致癲癇發作的發病機制尚不明確，可能與遺傳、年齡、發熱程度、免疫、感染等多因素有關［15-16］。熱性驚厥好發于6 個月至5 歲，高峰期為1～2 歲，6 歲以上較少發作，這種年齡相關性可能與嬰幼兒大腦發育不完善有關［13，17］，嬰幼兒大腦皮質分化不全、神經元的樹突、軸突形成不足，尚未形成大腦各區復雜的交織，出生后2歲神經膠質細胞才完全形成，神經纖維分支加長，至6 歲左右大腦半球的神經傳導通路完全髓鞘化。高熱會增加大腦需氧量，降低神經元興奮閾值，刺激神經元異常放電，繼而形成驚厥。高熱驚厥損傷了大腦皮質神經細胞，為日后癲癇發作埋下隱患［18-19］。本研究單因素分析發現，驚厥類型、高熱持續時間、驚厥持續時間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結果有關，且多因素Logistic 回歸分析顯示復雜性熱性驚厥、驚厥持續時間≥15 min、退熱后腦電圖結果異常是導致癲癇發作的高危因素。分析原因：復雜性熱性驚厥的患兒在體溫非高熱的時候也會發生驚厥，驚厥時間長，24 h內發作次數多，預后較單純性高熱驚厥差，進展為癲癇的風險較高［20］。多項研究表示，有癲癇家族史、腦電圖異常、復雜性熱性驚厥是熱性驚厥患兒繼發癲癇的影響因素［21-22］。

本研究顯示，熱性驚厥癲癇組的血清miR-148a-3p表達量高于熱性驚厥非癲癇組，且驚厥非癲癇組的血清miR-148a-3p表達量也高于對照組，提示miR-148a-3p 表達與熱性驚厥以及癲癇發作有關。有體外實驗分析miR-148a-3p 表達與癲癇發作的機制，結果顯示丙戊酸鈉通過激活miR-148a-3p/Mcl-1通路促進人神經母細胞瘤細胞凋亡，揭示miR-148a-3p高表達與癲癇發作有關［23］。miR-148a-3p是由內源基因編碼的單鏈RNA 分子，通過與靶信使mRNA 特異性結合，調節其他基因的表達。miR-148a-3p轉錄獨立于其他基因，并不翻譯成蛋白質，miR-148a-3p作為天然存在的基因表達的調控分子，導致癲癇的機制可能與神經毒性有關［25］。本研究發現miR-148a-3p 預測熱性驚厥患兒繼發癲癇的靈敏度為83.33% ，特異度為74.42% ，提示miR-148a-3p 可以對熱性驚厥患兒是否癲癇發作的預后進行預測，miR-148a-3p能夠作為評價熱性驚厥疾病轉歸的預測指標。

HMGB1是重要的炎癥介質，在感染所致的高熱患兒中血清HMGB1處于較高水平，并且熱性驚厥患兒的血清HMGB1 水平高于僅高熱患兒。本研究顯示，熱性驚厥癲癇組的血清HMGB1水平高于熱性驚厥非癲癇組，并且驚厥非癲癇組的血清HMGB1水平也高于對照組，提示HMGB1水平與熱性驚厥引起的癲癇發作有關。HMGB1 在高熱驚厥患兒的作用機制：熱性驚厥患兒機體發生感染時，巨噬細胞活化，主動分泌HMGB1釋放至細胞外，同時分泌多種炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，激活環氧化酶途徑導致發熱，炎癥因子又會作用于單核細胞、內皮細胞，擴大炎癥反應。HMGB1 與癲癇發作的機制尚未完全明朗，可能與Toll樣受體機制有關，確切的分子機制有待深入分析。本研究發現HMGB1 預測熱性驚厥繼發癲癇的靈敏度為77.78%，特異度為68.60%，提示HMGB1具有一定的預測價值，可以作為熱性驚厥繼發癲癇的標志物。

本研究發現，25（OH）D 水平可能與熱性驚厥繼發癲癇有關，繼發癲癇的患兒血清25(OH)D 水平處于較低水平，低于無癲癇的熱性驚厥患兒，也明顯低于發熱但無驚厥的對照組患兒。目前已有研究證實維生素和微量元素缺乏易誘發癲癇，25（OH）D 是維生素D在體內的主要存在形式，不僅影響鈣磷代謝，而且與神經系統發育密切相關。25（OH）D具有營養神經作用，通過合成神經遞質，增強神經系統功能，促進嬰幼兒大腦發育。維生素D缺乏可使熱性驚厥嬰幼兒的神經元興奮性升高，膜電位異常，誘發癲癇。本研究顯示，血清25（OH）D 水平預測高熱驚厥患兒癲癇發作的靈敏度為72.22%，特異度為63.95%，具有一定的預測價值。鑒于維生素D 缺乏與癲癇發作存在關聯，臨床推薦熱性驚厥嬰幼兒可適當補充維生素D 改善營養狀態，降低癲癇發作風險。

血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平與熱性驚厥患兒癲癇發作有一定相關性，可作為臨床輔助診斷標志物。鑒于臨床條件限制，本研究樣本量較少，預測價值統計分析尚存在一定偏倚，今后還需擴大樣本量聯合多中心調查。另外，相關指標的分子機制也尚不明確，還有待體外實驗證實。