葛根素對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應的作用機制研究

孫輝 劉翠玲 姚靜 何秋婷 謝月 梁奇

〔摘要〕 目的 探討葛根素（puerarin， PUE）在脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞中的抗炎作用，并揭示其分子機制。方法 采用CCK-8比色法分別設置不同濃度的LPS和PUE，觀察對RAW264.7細胞活性的影響，篩選出合適的LPS造模濃度及PUE的給藥濃度。將細胞分為正常對照組、模型組（1 μg/mL）、PUE給藥組（12.5、25、50 μmol/L）。Griess法檢測一氧化氮（nitric oxide， NO）釋放量；ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）的含量；qRT-PCR法檢測環氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2） mRNA水平；Western blot法檢測誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）、COX-2、p-IκBα、p-p65蛋白表達水平。結果 與正常對照組比較，不同濃度的LPS誘導24 h，RAW264.7細胞存活率降低，但對細胞增殖無影響（P＞0.05），PUE在濃度100 μmol/L及以下時對RAW264.7細胞增殖也無影響（P＞0.05）；與模型組相比，PUE給藥組（12.5、25、50 μmol/L）NO、TNF-α、IL-1β及IL-6的釋放量顯著降低（P<0.01），COX-2的蛋白及mRNA表達水平顯著降低（P<0.05），iNOS、p-IκBα、p-p65的蛋白表達水平呈濃度依賴性降低（P<0.01）。結論 PUE的體外抗炎作用機制與抑制核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）信號通路相關。

〔關鍵詞〕 葛根素；脂多糖；RAW264.7細胞；炎癥；一氧化氮；一氧化氮合酶；NF-κB信號通路

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ?〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.008

Anti-inflammatory effects and mechanisms of Puerarin on LPS-induced RAW264.7 macrophages

SUN Hui， LIU Cuiling， YAO Jing， HE Qiuting， XIE Yue， LIANG Qi*

Bao'an TCM Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Shenzhen， Guangdong 518101， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the anti-inflammatory potential of Puerarin （PUE） in lipopolysaccharide （LPS）-induced RAW264.7 macrophages and reveal its potential molecular mechanisms. Methods The effects of different concentrations of LPS and PUE on the viability of RAW264.7 cells were determined by CCK-8 colorimetric method， and the appropriate LPS modeling concentration and PUE administration concentration were screened. Cells were divided into normal control group， model group （1 μg/mL）， and PUE administration group （12.5， 25， 50 μmol/L）; Griess assay was used to assess the nitric oxide （NO） concentration; tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6） content was measured by ELISA; cyclooxygenase-2 （COX-2） mRNA levels were detected by qRT-PCR; the protein expression levels of inducible nitric oxide synthase （iNOS）， COX-2， p-IκBα， and p-p65 were determined by Western blot. Results Compared with the normal control group， the survival rate of RAW264.7 cells decreased after 24 h of LPS induction at different concentrations， and there was no effect on cell proliferation （P>0.05）， PUE has no significant cytotoxic effects at or below the concentrations of 100 μmol/L （P>0.05）; Compared with the model group， PUE administration group （12.5， 25， 50 μmol/L） displayed favorable inhibitory effects on the release level of NO， TNF-α， IL-1β and IL-6 （P<0.01）， and the protein and mRNA expression levels of COX-2 significantly decreased （P<0.05） in LPS-induced RAW264.7 cells， and it is the same for the expression levels of iNOS， p-IκBα， p-p65 （P<0.01）. Conclusion The anti-inflammation mechanisms of PUE is related with nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 puerarin; lipopolysaccharide; RAW264.7 cells; inflammation; nitric oxide; inducible nitric oxide synthase; NF-κB signaling pathway

炎癥是機體對有害刺激（如病原體、受損細胞或刺激物）的復雜生物反應。炎癥反應導致疼痛、發熱、瘙癢、紅脹，甚至誘發過敏、哮喘及腫瘤等[1-2]。炎癥介導的關鍵因子核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）是Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR）通路中的重要信號分子。這些因子的調節被廣泛認為是抑制各種炎癥的良好策略。更具體地說，NF-κB是促炎基因轉錄調節的一個重要因素，如白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、一氧化氮（nitric oxide， NO）誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）和環氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2），也是NF-κB激活所必需的[3-4]。因此，NF-κB活化與炎癥性疾病密切相關，針對NF-κB的抗炎藥物的開發備受關注。

中藥葛根是解表退熱的代表性藥物之一，廣泛應用于治療臨床炎癥性疾病，如發熱[5]、疼痛[6-10]及類風濕關節炎[11-12]等。葛根素（puerarin， PUE）是葛根的主要有效成分，雖然其抗炎活性已有報道[13]，但是PUE的抗炎活性所涉及的細胞機制仍有待闡明。本研究通過將PUE作用于脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，研究PUE抗炎癥反應的作用及機制，為其進一步的開發及臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 ?細胞及藥品

小鼠RAW264.7巨噬細胞購自中國科學院武漢分院細胞庫。PUE（上海詩丹德標準服務技術有限公司，批號：110752-202013，純度≥98%）；LPS（美國Sigma-Aldrich公司，批號：#028M4094V）。

1.2 ?主要試劑

CCK-8試劑盒（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：21266840）；胎牛血清（德國Nobimpex公司，批號：A115-500）；DMEM培養基、PierceTM BCA蛋白檢測試劑盒（上海賽默飛世爾科技公司，批號：8122524、WK342259）；UltraSYBR Mixture PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技股份有限公司，批號：CW2601M）；cDNA反轉錄試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，批號：H8203980）；iNOS（上海Abcam公司，批號：ab178945）；COX-2（批號：37843）、p-IκBα（批號：2859S）、IκBα（批號：4814S）、p65（批號：8242S）及p-p65（批號：3033S）均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 ?主要儀器

CO2細胞培養箱、高速冷凍離心機（上海賽默飛世爾科技有限公司，型號：371、Sorvall ST 16R）；蛋白電泳儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司，型號：Bio-Rad 1658029）；化學發光熒光成像儀（上海天能科技有限公司，型號：5200Multi）；醫用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司，型號：HYC-198S）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-2FD）。

2 方法

2.1 ?細胞培養及傳代

RAW264.7細胞在37 ℃下于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM中培養，細胞在37 ℃、5% CO2空氣環境中生長。待細胞密度長至90%時進行傳代，用細胞刮刀將貼壁細胞刮下，然后吹勻使細胞成單個懸浮狀態，再轉移至15 mL離心管，1000 r/min（離心半徑8 cm），離心5 min，棄上清液，加入新的培養基重懸，按照1∶3進行接種。

2.2 ?細胞分組及細胞存活率檢測

取對數生長的細胞，按照1×106個/mL接種于6孔板，設置正常對照組、模型組（0.01、0.1、1、10 μg/mL）、PUE給藥組（7.5、12.5、25、50、100 μmol/L）。待細胞貼壁過夜，正常對照組加入新鮮培養基，PUE給藥組加入不同濃度PUE，每組設3個復孔，培養24 h；每孔加入20 μL CCK-8，放入細胞培養箱內繼續孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（OD）值，計算細胞存活率。

2.3 ?細胞上清液中NO釋放量的檢測

取對數生長期的細胞，按照1×106個/mL接種于96孔板，設置正常對照組、模型組（1 μg/mL）、PUE給藥組（12.5、25、50 μmol/L），待細胞貼壁過夜，PUE給藥組加入PUE預處理0.5 h，除正常對照組，其余各組加入LPS（1 μg/mL）培養24 h。吸取各組細胞上清液50 μL，與Griess試劑混合，并在室溫下孵育15 min。使用NaNO2作為標準，在540 nm波長處測定NO濃度。

2.4 ?細胞上清液中炎性細胞因子的檢測

取對數生長期的細胞，按照1×106個/mL接種于6孔板，分組及處理同“2.3”，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書定量檢測培養基中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6的含量。

2.5 ?COX mRNA水平的檢測

細胞分組及給藥方法同“2.3”，收集細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，應用逆轉錄試劑盒制備cDNA。所有引物均由上海Invitrogen公司合成，使用Primer-BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）平臺設計COX-2、GAPDH引物序列（見表1）。使用RT-PCR試劑盒在羅氏LightCycler480實時系統（德國Roche Diagnostics公司）中進行qRT-PCR分析。

2.6 ?iNOS、COX-2、NF-κB信號通路蛋白表達的檢測

細胞分組及給藥方法同“2.3”，待細胞貼壁過夜，各給藥組加入PUE預處理0.5 h，除正常對照組，其余各組加入LPS（1 μg/mL）培養30 min，收集細胞，加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的裂解液冰浴裂解30 min，在4 ℃條件下12 753 r/min離心15 min，離心半徑8 cm；收集上清后，按照BCA蛋白定量試劑盒說明進行蛋白定量，吸取部分蛋白液與5×蛋白質上樣緩沖液混勻，97 ℃金屬浴煮5 min，通過10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分離蛋白質提取物，并轉移至PVDF膜。脫脂奶粉封閉2 h，再加入iNOS、COX-2、p-IκBα、IκBα、NF-κB/p65、p-p65抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，并與在封閉溶液中稀釋的過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育2 h，洗滌后，使用ECL發光液檢測蛋白質。

3 結果

3.1 ?LPS對RAW264.7細胞活性的影響

為了評估LPS對RAW264.7細胞的細胞毒性作用，將細胞與不同濃度的LPS（0.01、0.1、1、10 μg/mL）孵育24 h。CCK-8結果顯示，與正常對照組比較，在24 h內，LPS的濃度為0.01、0.1、1、10 μg/mL時，RAW264.7細胞存活率降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），說明各濃度下LPS對細胞無毒性或毒性不明顯。詳見表2。

3.2 ?PUE對RAW264.7細胞活性的影響

為了評估PUE對RAW264.7細胞的細胞毒性作用，將細胞與不同濃度的PUE（7.5、12.5、25、50、100 μmol/L）孵育24 h。CCK-8結果顯示，與正常對照組比較，在24 h內，PUE給藥組濃度為7.5、12.5、25、50、100 μmol/L時，RAW264.7細胞存活率逐漸降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），說明各濃度下PUE對細胞無毒性或毒性不明顯。詳見表3。最后，選擇12.5、25、50 μmol/L作為PUE的給藥濃度，用于進一步研究。

3.3 ?LPS對RAW264.7細胞中炎癥因子表達的影響

與正常對照組比較，除模型組（0.01 μg/mL）外，其余3個濃度（0.1、1、10 μg/mL）均可明顯誘導RAW264.7細胞產生炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6（P＜0.05），并呈現一定的濃度依賴關系。但由于1 μg/mL和10 μg/mL濃度之間誘導炎癥因子水平差異無統計學意義（P＞0.05），故選擇1 μg/mL的LPS作為造模濃度。詳見表4。

3.4 ?PUE對LPS誘導的RAW264.7細胞中炎癥因子表達的影響

與正常對照組比較，模型組上清液中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，PUE給藥組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平呈濃度依賴性降低（P＜0.05）。詳見表5。

3.5 ?PUE對LPS誘導的RAW264.7細胞中NO和iNOS表達的影響

與正常對照組比較，模型組中NO的產生以及iNOS的表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，PUE給藥組LPS誘導的RAW264.7中NO的產生以及iNOS的蛋白表達水平降低（P＜0.05）。詳見表6、圖1。

3.6 ?PUE對LPS誘導的RAW264.7細胞中COX-2表達的影響

與正常對照組比較，模型組中COX-2的mRNA和蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，PUE給藥組COX-2的mRNA和蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。詳見圖2、表7。

3.7 ?PUE對NF-κB信號通路的影響

與正常對照組比較，模型組NF-κB信號通路中p-p65和p-IκBα表達明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，PUE給藥組p-p65和p-IκBα水平呈濃度依賴性降低（P＜0.05）。詳見圖3。

4 討論

炎癥是病原體、受損細胞或刺激物攻擊機體產生的基本防御機制。炎癥反應有多種生理目的，如宿主防御、組織修復反應和穩態恢復。然而，這種反應會產生病理后果，導致炎癥組織損傷、化生和穩態設定點的改變。因此，機體需要對炎癥反應進行適當的調節。一些有害刺激，如病原體、受損細胞或刺激物可刺激機體產生NO，但過量產生NO會在巨噬細胞中誘導慢性炎癥反應[14]。慢性NO過量產生也涉及其他負面的細胞生理功能，如DNA損傷和誘變[15]。在本研究中，PUE抑制LPS刺激的RAW264.7細胞中NO的產生。其次，PUE還以劑量依賴的方式抑制LPS誘導的iNOS蛋白水平升高。這些結果表明，PUE可能是一種潛在的抗炎化學物質。前列腺素（prostaglandin， PG）是來源于花生四烯酸的類脂化合物。NO、iNOS和PG維持體內平衡功能并介導致病機制，包括炎癥反應。由促炎刺激物、細胞因子、激素和生長因子誘導的COX-2是炎癥中PG形成的重要來源[16-18]。COX-2酶抑制劑被開發用于治療與關節炎相關的炎癥[19-20]和疼痛[21-22]。促炎細胞因子往往會通過誘發機體產生發熱、炎癥、組織破壞或全身炎癥使疾病惡化。IL-6是一種關鍵的炎癥細胞因子，在誘導下游炎癥反應中起著重要作用。在這項研究中，我們發現PUE抑制LPS誘導的TNF-？琢、IL-1？茁和IL-6的上調。PUE處理以劑量依賴的方式減少LPS誘導的NO釋放。此外，PUE下調LPS誘導的iNOS、COX-2、p-IκBα、p-p65的表達。NF-κB可與κB的抑制劑IκBα結合，當給予誘導炎癥反應的刺激時，NF-κB被IκBα降解激活，并導致其易位到細胞核中，以促進炎癥基因的表達，包括iNOS、COX-2和IL-6。

綜上所述，體外實驗表明PUE可能是一種具有潛在抗炎作用的天然活性化合物，可以抑制炎癥因子的產生以及炎癥反應，這種抑制作用可能與調控NF-κB信號通路密切相關。本研究結果可為PUE用于治療相關炎癥性疾病以及進一步的研究利用提供科學參考。

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〔收稿日期〕2022-11-25

〔基金項目〕廣東省粵深青年聯合基金項目（2019A1515111192）。

〔第一作者〕孫 ?輝，男，碩士研究生，研究方向：中藥藥理研究。

〔通信作者〕*梁 ?奇，男，主任中藥師，E-mail：liangqi70@gzucm.edu.cn。