穿心蓮種質產量性狀與藥用成分分析*

王雨霞，鄒秀崽，李春雨，張可，梁梓珊，王宏斌，段禮新，靳紅磊，沈奇

廣州中醫藥大學中藥學院藥用植物生理生態研究所 / 國際中醫藥轉化醫學研究所，廣東 廣州 510006

穿心蓮（AP，Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees），又名一見喜、苦膽草、印度草、春蓮秋柳等。以秋初采摘的干燥地上部分入藥，味極苦，性寒（中國植物志，2006；中華人民共和國藥典，2020）。穿心蓮原產地為印度半島和斯里蘭卡，在東南亞國家具有悠久的民間用藥歷史（陳蓉，2015）。國內穿心蓮主要為東南亞引種栽培，目前在我國華南地區廣泛栽培，現在已發展成為最具代表性的“嶺南藥材”之一。穿心蓮栽培區域相對集中，主產于廣西貴港、玉林、南寧，廣東湛江、清遠、陽江，以及福建漳浦等地。主產區產量占全國穿心蓮總產量的90%以上，其中以廣西貴港及廣東湛江種植面積最大（閆婕等，2013）。

穿心蓮有廣譜抗菌和抗病毒的作用，現代藥理研究表明，穿心蓮具有清熱解毒、抗腫瘤、抗感染、抗糖尿病、抗心血管疾病、抗菌消炎、消腫止痛等多種藥理活性，臨床多用于治療肺病、肝炎、神經退行性疾病、自身免疫性疾病、炎癥性皮膚病、細菌性痢疾、尿路感染、急性扁桃體炎、肺炎和流行性感冒等（張敬君，2007；蘭繼平等，2016）。穿心蓮主要藥用成分為烷型二萜類化合 物，主 要 包 括 穿 心 蓮 內 酯（AD，androgra‐pholide）、新 穿 心 蓮 內 酯（NAD，neoandrogra‐pholide）、14-去氧穿心蓮內酯（14-DAP，14-deoxyan‐drographolide）及脫水穿心蓮內酯（DDAD，dehy‐droandrographolide）等（Zhou et al.，2013；曾吳靜等，2019）。

近年來，隨著穿心蓮需求量的大幅增長，其品質不穩定、栽培產值低等現象越來越嚴峻，已嚴重制約其相關產業的發展（Raina et al.，2013；周芳等，2021）。其主要原因是穿心蓮遺傳背景單一，種質資源多樣性貧乏、缺乏系統的資源鑒選及優良新品種的選育。種質資源多樣性評價是優良資源鑒定及新品種選育的基礎，也是實現標準化規模化栽培的關鍵（陳東亮等，2020）。因此，本研究收集來自廣東湛江和廣西貴港的兩個主要穿心蓮產區的種植資源，對其主要的產量性狀進行統計，并對主要藥用成分含量進行分析，通過相關性分析和聚類分析，系統地對穿心蓮種質資源遺傳多樣性進行評價，并篩選出優質的材料，為后期穿心蓮遺傳育種及品種開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

穿心蓮種質資源研究材料主要來源于課題組在2021 年自主收集的來自廣東湛江和廣西貴港的種質資源材料（表1），由課題組采用條形碼技術鑒定為藥用植物穿心蓮。

表1 材料編號及采集地Table 1 Material number and collection place

1.2 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀（DAD 檢測器），Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；甲醇和乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為超純水；對照品AD（批號5508-58-7，w=99.33%）、NAD（批號27215-14-1，w=99.25%）、14-DAP（批號4176-97-0，w=97.72%）和DDAD（批號134418-28-3，w=98.73%）均購自成都普瑞法科技開發有限公司；Sartorius型十萬分之一分析天平和萬分之一分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.3 產量相關性狀調查

對收集到的穿心蓮種質進行整理編號和田間種植。于2021 年4 月初在廣東省廣州市番禺區育種基地進行苗床播種，于5月中旬進行移栽，移栽株行距分別為50 cm×50 cm。8 月中旬，取單株生長一致的葉片進行內酯含量測定。根據供試材料表型差異的相關因素，同時參考沈奇等（2016）擬定穿心蓮產量相關性狀的記載標準（表2）。待單株進入終花期后，取地上部分對產量相關性狀進行測量。測量指標具體包括：生育期、葉面積、葉片質量、單株生物量、株高和一次分枝數等6個性狀。其中，葉面積計算以平均值進行統計分析，參照日本田邊貫氏經驗公式：葉面積S=0.7×L×W（L為葉長，W為葉寬）來計算（龐志強等，2019；曾吳靜等，2019）。

表2 穿心蓮表型性狀記載標準Table 2 Recording standards for phenotypic traits of Andrographis paniculata

1.4 穿心蓮主要藥用成分的含量測定

穿心蓮主要藥用成分的含量測定，參考《中華人民共和國藥典》（2020 版）一部中穿心蓮的含量檢測方法進行部分優化，采用超聲提取法對樣品進行提取（周汝順等，2019；郭佳佳等，2020），采用高效液相色譜法（HPLC）進行含量測定（肖敏等，2017；莊子瑜等，2021），具體方法如下。

1.4.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為Agilent C18色譜柱；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表3 中的規定進行梯度洗脫；檢測波長為205 nm。流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，采集時間60 min。理論板數按穿心蓮內酯峰計算應不低于8 000。

表3 含量測定洗脫條件Table 3 Assay elution conditions

1.4.2 對照品溶液的制備分別取AD、NAD、14-DAP 和DDAD 的對照品適量，用十萬分之一分析天平精密稱定，得4 個對照品質量依次為3.93、3.38、3.63 和3.96 mg，置2 mL 容量瓶中，先加甲醇1 mL，超聲溶解5 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液的母液，AD、NAD、14-DAP、DDAD 等4 個對照品母液濃度依次為1.97、1.69、1.82和1.98 mg/mL。

1.4.3 供試品溶液的制備取本品新鮮植物葉片約0.3 g，用萬分之一分析天平精密稱定，置于裝有適量石英砂的5 mL 離心管中，液氮冷卻30 s，用冷凍型高通量組織研磨器（60.0 Hz，?20 ℃）研磨90 s，精密加入φ=40%的甲醇1.5 mL，搖勻，稱定質量，超聲處理30 min（功率250 W，頻率40 kHz），放冷，再稱定質量，用φ=40%的甲醇補足減失的質量，搖勻，離心10 min（轉速為12 000 r/min），用注射器吸取上清液，微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取續濾液至樣品瓶中，即得。

1.4.4 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定。

1.5 穿心蓮主要藥用成分檢測的方法學考察

1.5.1 線性關系考察取1.4.2項下的混合對照品溶液的母液適量，精密加入適量甲醇將其分別稀釋成系列質量濃度的混合對照品溶液。各取10 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定。以對照品溶液的進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，考察線性關系。

1.5.2 精密度考察取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，計算樣品含量和相對標準偏差（RSD），考察儀器精密度。

1.5.3 穩定性考察取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于 0、2、4、6、8、16 和 24 h 進樣測定。記錄峰面積，計算樣品含量和RSD，考察處理后供試品溶液的穩定性。

1.5.4 重復性考察取同一批供試品，平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積。計算樣品含量和RSD，考察方法的重復性。

1.6 數據統計分析

利用Excel進行數據統計及處理，計算平均值、標準差、變幅和變異系數等；采用SPSS 26.0 對數據進行相關性分析；采用R語言（版本R-4.1.2）進行K-means聚類分析。

2 結果與分析

2.1 穿心蓮產量相關性狀統計

對來自廣東湛江及廣西貴港的7份穿心蓮種質資源進行田間種植，發現其資源分離較為明顯。因此選擇變幅較大的資源進行單株掛牌，進行表型及成分含量的評價。對7 份種質共選擇66 份材料，其中有45 份材料來自廣東湛江，有21 份來自廣西貴港。根據大田實地考察和文獻擬定穿心蓮的表型性狀記載標準，對穿心蓮單株材料的生育期、葉面積、葉片質量、單株生物量、株高和一次分枝數等分別進行統計（表2）。結果表明，66份材料中，表型性狀特征差異顯著，開花時間、葉片大小及植株形態差異較大（圖1）。

圖1 穿心蓮表型性狀特征Fig.1 Phenotypic traits of Andrographis paniculata

進一步對采集的產量相關數據進行分析發現，統計指標中單株生物量變異最大，變幅為100 ～624 g，變異系數為0.41；其次是葉片質量和葉面積，而一次分枝數、生育期和株高的變異系數相對較小（表4）。

表4 穿心蓮產量相關性狀統計Table 4 Statistics of yield characters of Andrographis paniculata

同一來源的穿心蓮品種均存在較大變異。對同一來源材料進行分析發現，種質AP1 的單株生物量和株高較小，一次分枝數較少；AP2生育期較短，葉面積最小（13.58 cm2），單株生物量和株高較小 ；AP3 生育期較長，葉面積較大，單株生物量和株高最大（468.80 g；90.60 cm），一次分枝數最多；AP4生育期較長，葉面積最大（24.09 cm2），單株生物量和株高較大，一次分枝數較多；AP5生育期較短，葉片較小，單株生物量最小（274.62 g）；AP6生育期較短，葉面積和單株生物量較小，生育期較短，葉面積和單株生物量較小；AP7生育期較長，單株生物量和株高較大。由此可見，AP2 和AP3 這兩個品種在7 份供試種質中產量性狀變異最為顯著。AP2 主要具有生育期較短、葉面積較小、單株生物量較小等特點，而AP3 卻相反，主要表現為生育期較長、葉面積較大、單株生物量較大等特點（圖2）。

圖2 穿心蓮不同品種間產量性狀變異的對比分析Fig.2 Comparative analysis of phenotypic traits among different varieties of Andrographis paniculata

其中，單株生物量最大的是AP3-19 號種質，其地上部分鮮質量為624 g，生育期較長；單株生物量最小的是AP2-5 號種質，其質量為100 g，生育期較短，葉面積較大。葉面積最大的是AP4-10號種質，其葉面積為38.42 cm2；而AP2-4 號種質的葉面積最小，為6.12 cm2。通過表型數據分析發現，供試材料中產量構成因素差異較大，且不同品種內部出現較大變異，說明穿心蓮種質混雜程度較高，值得進一步進行資源純化及鑒選。

2.2 穿心蓮主要藥用成分檢測的方法學考察

2.2.1 線性關系考察取稀釋成系列質量濃度的混合對照品溶液各10 μL 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定。以對照品溶液的進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸，得4個對照品的回歸方程分別為

結果表明，AD 在0.614 1～19.650 0 μg 范圍內線性良好；NAD在0.528 1～16.900 0 μg范圍內線性良好；14-DAP 在0.567 2～18.150 0 μg 范圍內線性良好；DDAD 在0.618 8～19.800 0 μg 范圍內線性良好（圖3）。

圖3 穿心蓮標準曲線圖Fig.3 Standard curve of Andrographis paniculata

2.2.2 精密度考察取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續進樣6 次，測得AD、NAD、14-DAP、DDAD 等4個內酯成分總含量的相對標準偏差RSD 為0.50%（n= 6）。結果表明，儀器精密度良好。

2.2.3 穩定性考察取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于 0、2、4、6、8、16 和 24 h 進樣測定。測得4 個內酯成分總含量的RSD 為1.52%（n= 7）。結果表明供試品溶液中上述4 個成分在24 h內穩定性良好。

2.2.4 重復性考察取同一批供試品，平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，測得4 個內酯成分總含量的RSD 為3.21%（n= 6）。結果表明方法的重復性較好。

2.3 穿心蓮主要藥用成分分析

穿心蓮主要藥用成分為二萜內酯類化合物，按照上述測定方法對66 份供試穿心蓮材料的主要藥用成分進行檢測。結果表明，不同材料間4種內酯成分均呈現較大變異。其中，內酯含量最高的是AD，平均值為4.355 9 mg/g，變幅為1.538 5 ～6.594 4 mg/g；其 余 依 次 為NAD、14-DAP、DDAD；總內酯含量平均值為6.787 8 mg/g，變幅為2.305 2 ～9.290 4 mg/g。此外，AD 和總內酯含量變異系數相對較小，而NAD、14-DAP和DDAD的含量變異系數均較大，說明這4種內酯成分的含量在穿心蓮不同材料間的差異顯著（表5；圖4）。

圖4 穿心蓮主要藥用成分分析（HPLC圖）Fig.4 Analysis of the main medicinal components of Andrographis paniculata(HPLC chart)

表5 穿心蓮主要藥用成分統計Table 5 Statistics of main medicinal components of Andrographis paniculata

進一步分析同一來源的不同穿心蓮材料間內酯含量差異。在7 份供試種質中，AP1 的NAD、14-DAP、DDAD 和總內酯含量最高，但AD 含量卻不高；AP2 的AD 和總內酯含量較高；AP3 的各內酯含量均較低，且變幅最大；AP4 的AD 含量較高；AP5的AD含量最高，總內酯含量較高；AP6的AD含量較低；AP7的總內酯含量較低。綜上，結合前面的表型性狀分析結果得出，AP2和AP3的分離度較大，AP2 的二萜內酯類含量較高但生物量較小，而AP3的二萜內酯類含量最低但生物量卻最大。

此外，AD 含量最高的是AP3-19 號種質，為6.594 4 mg/g，其生育期較長，單株生物量也最大（624 g）；最小的是AP3-6 號種質，為1.538 5 mg/g，其生育期較短，單株生物量較大。總內酯含量最高的是AP2-2 號種質，為9.290 4 mg/g，其生育期較短，AD含量較高。

2.4 穿心蓮產量性狀及主要藥用成分的相關性分析

對所收集到的表型數據和成分含量檢測數據進行相關性分析。分別采用皮爾遜及斯皮爾曼兩種分析方法計算相關系數，結果發現，生育期、葉面積、葉片質量、單株生物量、株高和一次分枝數等產量相關數據之間呈正相關，其中葉面積和葉片質量之間呈極強顯著正相關；四種二萜內酯類含量和總內酯含量之間也呈顯著正相關，其中AD 和總內酯含量之間呈極強顯著正相關；但是產量相關數據與成分含量之間基本呈負相關。

其中，生育期與葉面積、葉片質量、單株生物量、株高和一次分枝數等呈顯著正相關，與NAD 和DDAD 含量呈顯著負相關；葉面積和葉片質量也與單株生物量、株高和一次分枝數等呈顯著正相關，與AD、NAD、DDAD 和總內酯含量之間呈顯著負相關；單株生物量和株高亦與一次分枝數呈顯著正相關，與NAD 和DDAD 含量呈顯著負相關，株高還與AD 和總內酯含量呈顯著負相關；一次分枝數與NAD、DDAD 和總內酯含量呈顯著負相關；AD、NAD、DDAD 和總內酯含量之間呈顯著正相關，而14-DAP 與AD 之間相關性較弱（表6）。

表6 穿心蓮植物學性狀及主要藥用成分相關性分析（n=66）1）Table 6 Correlation analysis of botanical traits and main medicinal components of Andrographis paniculata （n=66）

綜上所述，單株生物量主要由生育期、葉片大小、株高和一次分枝數決定，而內酯含量主要受葉片大小、單株生物量和株高的影響。此外，不同材料穿心蓮各成分之間含量趨勢一致，而產量與含量之間呈負相關，即生物量越大，主要藥用成分含量越低。

2.5 不同材料穿心蓮的聚類分析

將以上采集到的統計數據采用K-means法對66份供試穿心蓮材料進行聚類分析。聚類結果顯示，66 份穿心蓮材料主要分為兩大類群。I類群包含40份主要來自于AP1、AP2、AP5 和AP6 的材料，進一步可以劃分為4 個亞類群。其中I-1 亞類群具有生育期較短、葉面積較大、生物量較大、總內酯含量較高的特點；I-2 亞類群主要表現為生物量較小、內酯含量較低；I-3 亞類群具有生育期較短、葉面積較小、生物量較小、內酯含量高等特征；I-4 亞類群主要表現為生育期短、葉面積小、生物量小、內酯含量高。此外，I-2～ I-4的種質較為混雜，包括多個種質的材料，且I-4 亞類群的材料葉面積及生物量均為供試材料的最低值。I 類群的材料整體上具有生育期較短、葉面積較小、生物量較小、內酯含量較高的共同特征（圖5）。

圖5 不同穿心蓮材料的聚類圖Fig.5 Clustering diagram of different Andrographis paniculata materials

II類群中聚集了26份主要來自于AP3、AP4和AP7 的材料，分為3 個亞類群。其中II-1 亞類群主要表現為生育期較長、葉面積較大、生物量最大、內酯含量低，且種質幾乎為AP3 的材料；II-2 亞類群具有生育期最長、葉面積最大、生物量較小、總內酯含量較低等特征；II-3 亞類群主要表現為生育期較長、生物量較大、總內酯含量較低，且種質較為混雜。II類群總體表現為生育期較長、葉面積較大、生物量較大、內酯含量較低等特點（圖5）。

3 討 論

種質資源是培育優良品質的遺傳物質基礎，豐富的遺傳變異是藥用植物優良新品種選育的基礎。種質資源的挖掘、創新、選擇和穩定變異是植物育種的關鍵（馬靜等，2010）。遺傳多樣性（genetic diversity）是生命進化和適應的基礎，種內遺傳多樣性越豐富，物種對環境變化的適應能力也越大（葛頌等，1994；劉華招等，2009）。而變異系數是反映數據分布狀況的指標之一，普遍地用于反映某一總體各單位標志值的差異程度、集中或離散狀況。變異系數越大，代表植物的遺傳多樣性越豐富（王文森，2007；楊洪升等，2017）。因此，遺傳多樣性研究對于培育植物新品種具有重要意義。基于此，本研究系統地對穿心蓮種質產量性狀與藥用成分的遺傳多樣性進行研究。不同供試材料進行表型性狀的統計發現均存在不同程度上的差異。穿心蓮的主要藥用成分中，AD（C20H30O5）、NAD（C26H40O8）、14-DAP（C20H30O4）和 DDAD（C20H28O4）成為2020 年版《中國藥典》里用于評價穿心蓮藥材品質優劣的指標成分（靳鑫等，2014；張曉等，2018）。4 種二萜內酯含量的高低在不同材料間也呈現出明顯的差異，變異系數整體上均較大。研究結果表明，穿心蓮材料存在較為豐富的遺傳多樣性，這可能是由于穿心蓮長期引種栽培嚴重且近些年來面積拓展，多代種植并沒有經過嚴格的種質篩選，造成穿心蓮種質資源混雜，材料純合性差（Devi，2016）。

對于性狀指標的相關性分析，我們同時使用SPSS 進行相關性分析時的皮爾遜和斯皮爾曼兩種分析方式。皮爾遜主要是針對供試數據呈現正態分布的情況，而斯皮爾曼主要針對供試數據呈現非正態分布的情況。統計的指標符合正態分布的有：單株生物量、株高、AD、14-DAP 和DDAD含量；不符合正態分布的有：生育期、葉面積、葉片質量、一次分枝數、NAD 和總內酯含量。供試指標并不全都符合正態分布，可能是因為人為選擇材料造成的影響，不具有隨機性。因此結合皮爾遜和斯皮爾曼兩種分析方式進行分析，兩者相關性分析方法呈現了一致的結果。穿心蓮的4種二萜內酯類含量與單株生物量之間呈負相關。由此可見，穿心蓮的有效成分含量與產量之間趨勢并不一致。說明材料選育時需要注重產量性狀和藥用成分之間的平衡。

聚類分析是數據挖掘中的一種重要技術，能夠通過無監督的學習過程發現隱藏的模式，具有獨立發現知識的能力（楊森，2014）。聚類分析結果表明，供試材料主要分為兩大類群。其中I 類群主要表現為生育期短、葉面積小、生物量小、內酯含量高，II類群則表現為生育期長、葉面積大、生物量大、內酯含量低。但從聚類分析來看，聚類結果和前期通過表型和內酯含量統計篩選出的結果并不完全一致，甚至沒有出現明顯的相關性，推測可能是因為表型分析與遺傳相關性并不大，表型分析是按照性狀特征來歸類的，而聚類結果和材料的來源地區也不符，出現一個亞類群里面存在多個種質的現象。以上結果進一步說明供試穿心蓮材料的純合度差、內部變異大，材料分離需要進行種質純化。因此，有必要對穿心蓮種質資源進行鑒選及進一步的育種。

藥用植物育種目標的選擇，需更加注重各性狀和代謝成分之間的相關性。雜交育種可以增加植物的遺傳多樣性，從而產生新的優良性狀（Acquaah，2012）。本研究旨在通過表型性狀和主要藥用成分的統計與分析對藥用植物穿心蓮進行種質資源鑒定，從產量構成因素和和主要藥用成分等兩方面綜合評價其遺傳多樣性，有針對性地篩選出穿心蓮的優良種質并確定出后期雜交育種的親本。根據不同表型性狀和主要藥用成分含量的對比分析、相關性分析及聚類分析，可知穿心蓮的遺傳多樣性較豐富。通過以上種質的評價及篩選，最后確定出AP3-4、AP3-19 等2 份材料，具有生物量較大，內酯含量較高等特點，進一步用于后期穿心蓮雜交育種研究的核心材料。研究內容為穿心蓮種質資源的品種選育提供數據與材料支撐。