非洲豬瘟病毒重組載體疫苗激發/加強免疫策略的初步研究

周曉慧,盧會鵬,張鑫宇,夏曉莉,孫懷昌

(1.揚州大學 獸醫學院,江蘇省重要動物疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇揚州 225009;2.江蘇農牧職業技術學院,江蘇泰州 225300)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是目前威脅世界養豬業非常重要的傳染病[1]。由于尚無安全、有效的疫苗,該病只能靠早期診斷、感染豬撲殺和生物安全措施進行控制,但不足以控制該病的廣泛流行[2]。非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)疫苗研究的重點是基因缺失苗和重組病毒載體疫苗,其中基因缺失苗是短期內較有希望的疫苗,免疫豬可以抵抗同源毒株的攻擊,但多不能抵抗異源毒株的攻擊,而且存在基因重組、毒力返強和病毒擴散等生物安全風險[3];重組載體疫苗是ASFV疫苗研制的長期目標,重點研究免疫保護性抗原基因及其傳遞方式,但相關研究很少[4-5]。

已經用于ASFV重組載體疫苗研究的病毒載體主要有腺病毒、痘苗病毒和偽狂犬病毒。其中,重組腺病毒載體疫苗用人腺病毒5型進行,可以感染豬等哺乳動物的多種細胞,抗原基因的表達水平較高,但容易產生抗載體免疫而影響疫苗的再次免疫[4];重組痘苗病毒載體疫苗用遺傳改造型安卡拉株進行,具有很好的安全性和較大的外源基因裝載容量,但誘導的免疫應答以細胞免疫為主[6-7];重組偽狂犬病毒載體疫苗具有安全性好、免疫周期長、成本低等優點,且該病毒載體可以同時插入多個外源基因,具有實現一針多防的目的優勢。應用弱毒疫苗株構建的重組病毒,免疫后可以誘導較好的體液免疫、細胞免疫以及粘膜免疫[8],是一個極具潛力的病毒活載體疫苗。

重組載體疫苗的激發/加強免疫策略可用相同和不同的病毒載體進行。其中,不同載體組合的免疫策略可以減輕抗載體免疫,并能誘導較全面的免疫應答,但具體的載體組合需要進行篩選[9-11]。為此,本研究構建表達ASFV CD2v-p30-p54融合抗原的重組偽狂犬病毒rPRV-F1,將其與表達相同融合抗原的重組腺病毒(rAd-F1)組成4個組合進行豬免疫試驗,旨在篩選較好的ASFV重組載體疫苗的激發/加強免疫策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬外周血單個核細胞(PBMC)分離液購自天津灝洋生物制品有限公司;ASFV熒光PCR檢測試劑盒購自青島立見公司;豬干擾素γ(IFN-γ)ELISA檢測試劑盒購自上海遠慕生物科技有限公司;RPMI 1640細胞培養液購自美國Thermo scientific公司;胎牛血清(FBS)購自上海雙洳生物科技有限公司;刀豆蛋白A(ConA)購自美國Thermo scientific公司;肝素鈉抗凝采血管購自山東永康生物科技有限公司;HRP標記羊抗豬IgG抗體購自英國Abcam公司;TMB顯色液購自碧云天生物科技有限公司;高保真PCR酶與限制性內切酶購自寶日醫生物技術有限公司;DH5α大腸桿菌、真核表達載體pcDNA3.0、PK-15、HEK-293A和BHK-21細胞系為揚州大學孫懷昌課題組保存;HNX株PRV由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供;ASFV抗體陽性血清由揚州大學農業部重點開放實驗室(P3實驗室)提供;ASFV融合基因F1(CD2v-p30-p54、 1 992 bp)由上海生工生物工程股份有限公司合成;表達ASFV融合基因CD2v-p30-p54的rAd-F1由揚州大學孫懷昌課題組構建[12];ASFV p54、p30和CD2v重組抗原由揚州大學孫懷昌課題組制備。

1.2 PRV同源重組載體的構建

用PvuⅡ酶切法切除pcDNA3.0載體的NEO表達盒,插入多克隆位點和P2A自裂解肽編碼序列(GenBank: MT559572.1)后的改造載體命名為pcDNA3-2。根據HNX株PRV的TK基因序列(GenBank:KM189912.1)設計PCR引物(表1),利用酚/氯仿抽提法從PRV感染PK-15細胞提取病毒基因組DNA,以提取的DNA為模板,用高保真PCR酶擴增TK基因的左、右同源臂,插入pcDNA3-2載體后獲得的同源重組載體命名為pTK。根據綠色熒光蛋白(GFP)基因設計1對引物(表1),反向引物引入Flag標簽,以pEGFP-C3(GenBank: U57607.1)載體為模板進行PCR擴增,克隆入pTK載體后獲得的同源重組載體命名為pTK-GFP。利用NheI和EcoRV雙酶切法將F1融合基因從pShuttle-F1載體上切下,插入pTK-GFP后獲得的同源重組載體命名為pTK-F1,其融合基因表達盒的結構如圖1所示。

表1 本研究使用的PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.3 重組PRV的制備

重組PRV-F1的制備按照文獻[13-14]的方法進行。將BHK-21細胞接種6孔細胞培養板,培養至80%滿層后,按照LipofectamineTM3000 Reagent說明書進行基因轉染,同源重組載體為1.5 μg/孔,PRV基因組DNA為1 μg/孔。當80%轉染細胞出現病變時反復凍融3次,離心后取上清液進行連續10倍稀釋,再次接種BHK-21細胞后用1%低熔點瓊脂糖覆蓋,如此進行3輪病毒噬斑純化。

在細胞培養皿(底面積為8 cm2)中將BHK-21細胞培養至80 %滿層。用含2 %FBS的RPMI1640培養基將純化的重組PRV-F1進行連續10倍稀釋,分別取10-4mL-1、10-5mL-1和10-6mL-1的病毒稀釋液10 μL加入培養皿,每個稀釋度設8個重復,感染后1 h吸棄病毒液,各皿用預熱至37 ℃的1%低熔點瓊脂糖覆蓋,凝固后在CO2培養箱內培養48 h,在熒光顯微鏡下計數各皿的綠色熒光噬斑數,計算重組病毒的滴度。

1.4 重組PRV的鑒定

在24孔板培養PK-15細胞,培養12 h后用rPRV-F1感染(MOI=0.5)。感染后24 h吸棄病毒液,細胞用含5 %脫脂乳粉和0.05%Tween20的PBS在37 ℃封閉1 h,依次用ASFV抗體陽性血清(1∶100)和FITC標記羊抗豬IgG(1∶2 000)進行免疫熒光染色,經DAPI反襯染色后進行熒光顯微鏡觀察。在70%感染細胞出現病變時,將細胞培養物反復凍融3次,SDS-PAGE分離后轉印硝酸纖維素膜,依次用ASFV抗體陽性血清(1∶500)和HRP標記羊抗豬IgG(1∶10 000)進行免疫印跡檢測。

1.5 試驗豬的免疫方案

將15頭21日齡ASFV雙陰性、PRV陰性[15-16]且未進行PRV疫苗接種的斷奶仔豬平均分為5組(n=3),第一組為rAd-F1/rAd-F1激發/加強免疫組,第二組為rPRV-F1/rPRV-F1激發/加強免疫組,第三組為rAd-F1/rPRV-F1激發/加強免疫組,第四組為rPRV-F1/rAd-F1激發/加強免疫組,免疫劑量均為107PFU/頭,免疫途徑為肌肉注射,激發免疫后第21天加強免疫1次,第五組為非免疫對照組。免疫后第0、7、21、28、42、56天采集抗凝血用于PBMC分離和IFN-γ檢測,采集非抗凝血用于血清分離和抗體檢測。

1.6 IgG抗體檢測

免疫豬的抗體檢測用常規間接ELISA進行,每樣品設3孔重復;包被抗原分別為ASFV CD2v、p30和p54重組抗原(2.5 μg/mL),其中CD2v抗原是大腸桿菌表達的CD2v胞內區蛋白片段[17],37 ℃包被1 h;封閉液為含5 %脫脂乳粉和0.05 %Tween 20的PBS,37 ℃封閉1 h;免疫豬血清稀釋倍數為1∶200,37 ℃孵育1 h;HRP標記羊抗豬IgG稀釋倍數為1∶10 000, 37 ℃孵育1 h;加入TMB底物,室溫避光顯色15 min;用1 mol/L硫酸終止反應,立即用酶標儀讀取各孔的OD450值;以P/N>2.1為判定標準,用Graphpad軟件對各組的抗體水平(OD450平均值)進行統計學分析,用Excel 2021軟件進行柱形圖繪制。

1.7 IFN-γ檢測

分別在免疫后第0、7、21、28、42和56天采集試驗豬的抗凝血,按照外周血淋巴細胞分離試劑盒說明書進行PBMC分離;用細胞培養液將細胞調整為5×106個/mL,分裝96孔細胞培養板,100 μL/孔;分別加入ASFV p54、p30和CD2v重組抗原(10 μg/mL),100 μL/孔,每樣品設3孔重復,設Con A(5 μg/mL)陽性對照和細胞培養液陰性對照;37℃刺激72 h后吸取各孔細胞培養上清,5 000 g離心10 min后吸取上清液,按照ELISA檢測試劑盒說明書進行豬γ干擾素檢測,設空白對照孔和標準品孔,以標準品濃度為橫坐標、OD450值為縱坐標繪制回歸曲線,根據曲線方程計算公式(R≥0.990 0)計算各孔的IFN-γ 濃度。

2 結果與分析

2.1 PRV同源重組載體的鑒定

對構建的PRV同源重組載體pTK-F1進行酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示能切出插入的 1 992 bpF1融合基因。對重組質粒DNA進行測序,結果顯示插入的F1基因無突變(圖2)。

圖2 融合基因的序列分析Fig.2 Analysis offusion gene sequence

2.2 重組PRV的制備

在同源重組載體與PRV基因組DNA共轉染后48 h收集細胞裂解液,經3輪病毒噬斑純化后可見典型的PRV噬斑,熒光顯微鏡下觀察的病毒噬斑為GFP陽性(圖3)。根據病毒噬斑數計算的rPRV-F1滴度為2.3×109TCID50/mL。

2.3 重組PRV的表達檢測

分別用rPRV-F1和rAd-F1感染細胞,感染后24 h用ASFV抗體陽性血清進行免疫熒光檢測,結果顯示兩個重組病毒感染細胞均為免疫熒光檢測陽性(圖4)。分別用rPRV-F1和rAd-F1感染細胞,設PRV和rAd感染對照組,感染后36 h用ASFV抗體陽性血清進行Western blot檢測,結果顯示rPRV-F1和rAd-F1感染細胞均能檢測到預期的約128 ku F1融合蛋白,而PRV和rAd感染細胞不能檢測到蛋白條帶(圖5-a和5-b);用Flag單克隆抗體進行免疫轉印檢測,結果顯示rPRV-F1感染細胞能檢測到P2A裂解釋放的GFP-Flag融合蛋白,而PRV感染細胞未能檢測到蛋白條帶(圖5-c)。

圖4 重組病毒感染細胞的免疫熒光檢測Fig.4 Immunofluorescence of recombinant virus-infected cells

圖5 重組病毒感染細胞的Western blot 檢測Fig.5 Western blotting analysis of recombinant virus-infected cells

2.4 試驗豬的抗體檢測

從免疫后第7天起,所有免疫豬均能檢測到抗原特異性IgG抗體,加強免疫后的抗體水平顯著升高(圖6)。在初免后第7天,rAd-F1/rAd-F1和rAd-F1/rPRV-F1免疫組的CD2v抗體水平高于其他兩組(P<0.05),p30抗體水平顯著高于其他兩組(P<0.01),4個免疫組的p54抗體水平無顯著差異;在初免后第21天,rAd-F1/rAd-F1免疫組和rAd-F1/rPRV-F1免疫組的CD2v抗體水平高于其他兩組(P<0.01或0.05),p30和p54特異抗體水平顯著高于其他兩組(P< 0.05);在初免后第28天(加強免疫后第7天),rPRV-F1/rAd-F1免疫組的CD2v抗體水平顯著高于其他3組(P<0.05或0.01),rAd-F1/rPRV-F1和rPRV-F1/rAd-F1免疫組的p30抗體水平顯著高于其他兩組(P<0.05),rAd-F1/rAd-F1免疫組的p54抗體水平顯著高于其他3組(P<0.05或0.01);到免疫后第56天(加強免疫后第21天),rPRV-F1/rAd-F1免疫組的CD2v抗體水平顯著高于其他3組(P<0.05或0.01),rAd-F1/rPRV-F1和rPRV-F1/rAd-F1免疫組的p30抗體水平顯著高于其他兩組(P< 0.01),rPRV-F1/rAd-F1免疫組的p54抗體水平顯著高于其他3組(P<0.05或0.01)。

圖6 免疫豬的抗原特異性抗體檢測Fig.6 Detection of antigen-specific antibodies in pigs immunized with different strategies

2.5 試驗豬的γ干擾素檢測

在免疫后不同時間采血分離PBMC,分別用ASFV CD2v、p30、p54重組抗原刺激72 h,細胞培養上清檢測結果顯示,從免疫后第7天起所有免疫豬均能檢測到抗原特異性γ干擾素,加強免疫后的γ干擾素表達水平顯著升高(圖7)。在免疫后第7天,4個免疫組的3種抗原特異性γ干擾素表達水平無顯著差異;在初免后第21天,4個免疫組的CD2v特異γ干擾素表達水平無顯著差異,rAd-F1/rAd-F1和rPRV-F1/rAd-F1免疫組的p30和p54特異γ干擾素表達水平高于其他兩組(P<0.05);在初免后第28天(加強免疫后第7天),rPRV-F1/rAd-F1免疫組的CD2v特異γ干擾素表達水平顯著高于其他3組(P< 0.05),rAd-F1/rAd-F1和rPRV-F1/rAd-F1免疫組的p30特異γ干擾素表達水平顯著高于其他兩組(P<0.05),4個免疫組的p54特異γ干擾素表達水平無顯著差異;到免疫后第56天(加強免疫后第21天),rPRV-F1/rAd-F1免疫組的CD2v特異γ干擾素表達水平顯著高于其他3組(P<0.01或0.001),p30和p54特異性γ干擾素表達水平也顯著高于其他3組(P<0.05或0.01)。

圖7 免疫豬PBMC的抗原特異性γ干擾素檢測Fig.7 Detection of antigen-specific IFN-γ in PBMC from immunized pigs

3 討 論

ASFV重組載體疫苗的研究重點包括免疫保護性抗原及其傳遞方法的選擇[18-19]。為此,本研究在構建rPRV-F1基礎上,將其與表達相同融合基因的rAd-F1組成4個組合進行豬免疫試驗,旨在篩選合理的ASFV重組載體疫苗的激發/加強免疫策略。為了便于rPRV-F1的篩選與純化,本研究利用P2A自裂解肽將ASFV融合抗原與GFP-Flag隔開,不僅可以在熒光顯微鏡下直接進行GFP陽性病毒噬斑的挑選,而且P2A裂解釋放的F1融合抗原可以獨立誘導免疫應答。另外,rPRV-F1感染細胞表達的F1融合蛋白較預測分子質量大48 ku,可能與其中CD2v和p54的糖基化修飾有關[20-21]。

在測試的4個免疫方案中,盡管rAd-F1/rAd-F1組合初次免疫后的抗原特異性抗體水平最高,但加強免疫后的抗體水平最低(p54抗體水平除外),可能與rAd強免疫原性及其誘導的抗載體免疫有關[20]。相反,盡管rPRV-F1/rAd-F1組合初次免疫后的抗原特異性抗體水平最低,但加強免疫后的抗體水平最高。在F1融合蛋白中,CD2v是ASFV的血吸附蛋白,自然感染豬的血吸附抑制抗體水平很低,據此認為CD2v是弱免疫原性蛋白,可能與細胞CD2分子的序列同源性有關[22-24]。但在本研究中,所有免疫豬的CD2v抗體水平與p30和p54抗體水平相似,可能與使用CD2v胞內區蛋白片段作為檢測抗原有關,因為CD2v胞內區與細胞CD2分子無序列同源性,利用CD2v胞內區重組抗原可以在ASFV感染豬檢測到高水平的特異抗體[17]。

γ干擾素是ASFV的保護性免疫指標之一[25]。本研究結果顯示,所有免疫豬的PBMC均能檢測到抗原特異性γ干擾素表達,而且加強免疫后的γ干擾素濃度明顯升高。在測試的4個免疫方案中,盡管rAd-F1/rAd-F1組合初次免疫后的抗原特異性γ干擾素表達水平最高,但加強免疫后的γ干擾素表達水平最低,進一步證明與rAd誘導的抗載體免疫有關。相反,盡管rPRV-F1/rAd-F1組合初次免疫后的抗原特異性γ干擾素表達水平最低,但加強免疫后的γ干擾素表達水平最高。

綜合考慮抗原特異性抗體和γ干擾素應答兩項指標,本研究結果表明rPRV/rAd組合是較好的ASFV重組載體疫苗的激發/加強免疫策略。