玉米漿對大球蓋菇培養料發酵的影響

姬快樂,高 瑩,賈曉桐,孫 寧,王萌萌,吳 瑕,趙立琴,范博文,楊鳳軍

(黑龍江八一農墾大學 園藝園林學院,黑龍江大慶 163319)

玉米漿(Corn slurry)是工業濕法加工玉米淀粉的副產物之一[10],在玉米淀粉生產過程中,為加快淀粉的釋放速度,加工前使用亞硫酸鈉溶液浸泡玉米粒,浸泡液經濃縮后得到的粘稠液體即為玉米漿[11]。玉米漿中富含可溶性糖類、可溶性蛋白質、多肽(以二肽為主)、游離氨基酸、脂肪酸、維生素、肌醇、水解酶等有機化合物及其無機離子[12],是微生物發酵的良好氮源。玉米漿作為生產抗生素、有機酸和其他發酵產品培養基源料已得到廣泛應用,如李晶等[13]的研究表明將玉米漿發酵液加入杏鮑菇的培養料中可顯著提高杏鮑菇的產量及生物學轉化效率;而使用玉米漿發酵液替代傳統杏鮑菇培養料中的氮源,可使杏鮑菇的營養價值得到顯著提高[14];馬麗峰等[15]的研究表明,在金針菇的栽培基質中加入玉米漿可有效縮短其栽培周期,提高產量和品質。但添加玉米漿對食用菌培養料發酵過程中理化性質變化的研究未見報道。

本研究旨在探討玉米漿對大球蓋菇玉米秸桿基料發酵進程的影響,明確發酵過程中基質理化性質的變化規律,揭示添加玉米漿對高溫階段微生物群落結構及多樣性影響,識別核心產熱代謝微生物的差異,分析理化性質與細菌群落和生物代謝間的關系,為闡明玉米漿對玉米秸稈發酵中作用提供參考,對農業廢棄物資源化利用具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米秸稈來源于黑龍江省大慶市大同區玉米田,新鮮無霉變。玉米漿來自于黑龍江八一農墾大學食品學院,尿素為市售材料。

1.2 試驗設計與樣品采集

試驗于2020年9月在中國黑龍江八一農墾大學實驗基地進行,為期9 d。將玉米秸稈切為長度2～3 cm的秸稈段備用。試驗共設兩個處理,CK處理為50 kg玉米秸稈中添加0.25 kg 的尿素;CS處理為50 kg玉米秸稈中添加4.45 kg玉米漿,通過添加以上兩種不同外源氮使兩處理初始C/N相同。混合料以1.5 m×1.5 m×1.5 m的錐形堆進行建堆發酵。每天測量堆體內溫度和環境溫度,在發酵過程中高溫期(3 d)翻堆1次,堆體物料基本理化性質詳見表1。

表1 原材料成分含量Table 1 Content of raw materials

1.3 樣品采集與指標測定

在第0、3、6、9天采集發酵堆體樣品,在3個深度(距堆體表面10 cm、30 cm、60 cm處)的6個不同點進行隨機取樣,并均勻混合,樣品風干用于理化性質測定;同樣方法另取第3天(高溫期)樣品,經液氮冷凍后存于-80 ℃冰箱,用于后期高通量測序。

利用有記憶存儲功能的美信自動溫度記錄儀DS192X測量堆體和環境溫度;含水率通過烘箱在105 ℃下將樣品烘干至恒量來測定;體積質量參照DB22/T 2420-2015方法測定[16];pH和電導率值利用pH測定儀和電導率測定儀測定[17];總碳(TOC)和全氮(TN)含量的測定分別使用外加熱重鉻酸鉀容量法和微量凱氏法測定[18];銨態氮通過KCl浸提-靛酚藍比色法進行測定[19];對第3天(高溫期)樣品送至美吉生物科技有限公司進行建庫測序。通過對樣本進行Miseq測序得到的PE reads根據overlap關系進行拼接,同時對序列質量進行質控和過濾,區分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學分析,進行繪制門與屬水平上物種分布的柱狀圖,并計算每個樣本中Alpha多樣性指數,Alpha多樣性指數包括能夠反映物種群落豐富度的ACE指數和Chao1指數,以及能夠反映物種群落多樣性的Shannon指數和Simpson指數。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 21.0對試驗數據進行統計分析,Duncan’s多重比較和T檢驗分析不同處理的影響差異,采用Origin 2019b 64Bit軟件進行繪圖,結構方程模型采用Amos 24.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中培養料理化性狀的變化

2.1.1 物理性狀 如圖1所示,CK與CS處理溫度均在第1.5天進入第一個高峰,但CS處理升溫快,且高溫期持續時間更長。CS處理最高溫度達到53.17 ℃,在第1天達到高溫期(50 ℃),持續近4 d;而CK的最高溫度為48.33 ℃,低于CS處理。

圖1 兩種發酵處理中培養料理化指標的變化Fig.1 Changes of physicochemical indexes of culture dishes in two fermentation treatments

堆制始期(第0天)CK和CS處理含水率相近,均在59%左右;第3天含水率降低至56%左右,CS處理比CK降幅更大;之后CS處理含水率持續增加,到第9天達到61%,CK含水率在第6天達最大值,第9天含水率降到最低水平(56%)。

兩堆體體積質量在前3 d顯著提高,第6天至第9天略低于第3天,但降幅很小,兩處理差異不顯著。

2.1.2 化學性狀 由圖1可知,從第0天～第9天,CK與CS處理的總有機碳含量(TOC)呈下降趨勢,且二處理間差異不顯著;而二者的全氮(TN)含量卻呈上升趨勢,導致C/N比降低。CS處理的的電導率總體呈上升趨勢,第9天的電導率為2 630 μS·cm-1,比第0天提高34.8%; CK處理的電導率總體呈下降趨勢,第9天的電 導率為1 630 μS·cm-1,低于第0天(1 810 μS·cm-1)。

從整個發酵進程來看,CK處理的銨態氮含量總體呈下降趨勢,至第9天時,銨態氮含量為0.35 g·kg-1,低于初始的銨態氮含量(0.38 g·kg-1),但二者差距不大;而CS處理的銨態氮含量總體呈上升趨勢并在第3天達到峰值(0.38 g·kg-1)。在發酵進程中,CK與CS處理pH均呈提高的趨勢,且CS處理始終高于CK,第0天兩處理pH相近,第9天CK和CS處理pH分別提高到7.31和7.65。補充氮源的種類不同,使得堆體內微生物群落的組成有所差異,導致了兩處理理化性質也存在一定差異。

2.1.3 理化因子之間的相互作用 圖2為CK與CS處理的結構方程模型,在CK中x2= 2.480,df=1,GFI=0.937;在CS處理中x2=0.023,df=1,GFI=0.999。(GFI:Goodness of Fit Index擬合指數;df:Degrees of Freedom自由度)。從結構方程模型可知,與CK相比,添加玉米漿作為補充氮源使得理化性質間的關系發生了改變。在CK處理中,溫度對全氮具有顯著的負面影響,體積質量對全氮具有顯著的正面影響,總有機碳對銨態氮具有顯著的正面影響。在CS處理中,溫度、電導率對銨態氮具有顯著的正面影響,電導率對全氮具有顯著的正面影響,總有機碳對銨態氮具有顯著的正面影響。

實線和虛線箭頭分別表示顯著和不顯著的關系。與箭頭相鄰的數字是標準化的路徑系數,類似于相對回歸權重,并指示關系的效應大小。箭頭寬度與關系的強度成正比。*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001。模型擬合狀況良好。GEI>0.9,則代表模型擬合狀況良好

2.2 高溫期細菌群落變化

2.2.1 細菌OTU變化 按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類,從CK處理和CS處理序列中分別獲得約471個OTU和393個OTU。韋恩圖能夠比較直觀的反應出兩個處理中細菌微生物群落組成相似性以及重疊情況。如圖3所示,添加玉米漿的CS處理與CK處理之間共有363個相同的細菌OTU。其中,CS處理中含有特異的細菌OTU數量為30個,而CK中含有特異的細菌OTU數量為108個,約為CS處理中得3.6倍。

圖3 細菌微生物群落OTU的韋恩圖Fig.3 Venn diagrams of bacterial microbial OTU

2.2.2 細菌微生物多樣性 Alpha多樣性指數是反映單個樣品的豐富度和均勻度的綜合指標,有多個衡量指標。如表2所示,CK處理的Simpson指數顯著低于CS處理。而CS處理的ACE,Chao1和shannon指數與均顯著低于對照,說明CS處理內微生物群落的豐富度比CK低。

表2 不同處理的細菌多樣性指數Table 2 Bacterial diversity index of different treatments

2.2.3 細菌群落相對豐度的變化 從圖4可知,兩處理門水平上都鑒定出4個優勢門,分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes),但不同處理的菌群豐度存在較大差異。在CK處理中占相對優勢的菌門為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門以及厚壁菌門,其相對豐度分別為45.59%、33.4%、11.7%以及7.39%。同樣地,在CS處理中占主要優勢的是變形菌門,相對豐度為58.91%;其次是放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門,相對豐度分別為24.11%、11.91%和2.97%。在CS處理中,擬桿菌門相對豐度降低,其余菌門相對豐度均有所增加。

相對豐度算法:A/B×0.01,A代表這個樣本某個屬的克隆序列,B代表在這個樣本中所有屬的克隆序列

2.2.4 高溫期優勢細菌菌屬組成的差異 如圖5所示,在高溫期采集的樣本中,鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)在CK中的相對豐度顯著高于在CS處理中的相對豐度,為CK處理中的優勢屬。芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、海藤黃色單胞菌屬(Luteimonas)和螯臺球菌屬(Chelatococcus)在CS處理中的相對豐度顯著高于其在CK中的相對豐度,為CS處理中的優勢屬。高溫期細菌微生物在門和屬水平上相對豐度的變化可能與玉米漿中含有較多的有機營養物質有關。

圖5 兩種發酵堆體內細菌微生物群落的變化Fig.5 Changes of bacterial microbial communities in two fermentation reactors

2.3 理化性質與微生物間的關系

由表3可知,芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬均屬于厚壁菌門,兩菌屬與pH、電導率顯著正相關,與體積質量呈顯著負相關。芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬具有分解纖維素的能力,可以加快堆肥的反應進程。海藤黃色單胞菌屬屬于變形菌門,它與全氮顯著正相關,與碳氮比顯著負相關;其屬于反硝化細菌,可在一定程度上提高堆體的全氮含量[20]。鏈霉菌屬屬于放線菌門,與pH、電導率呈顯著正相關。橄欖形菌屬與全氮呈顯著負相關;與碳氮比呈顯著正相關。其具有降解芳香族化合物功能[21],在升溫期大量繁殖,可分解物料中的纖維素及半纖維素,導致C/N發生變化。

表3 理化性質與微生物間相關性分析Table 3 Correlation analysis between physical and chemical properties and microorganisms

3 討 論

在發酵過程中,生物分解物料中有機物的同時會產生大量的熱量,溫度是堆體發酵過程中一個非常重要的指標,微生物活動越旺盛,產熱越多,進而堆體溫度也越高[22]。在發酵過程中,CS處理的最高溫度高于CK處理,且高溫期持續時間更長,這可能與玉米漿的成分有關,玉米漿中含有多種易被降解的氨基酸、蛋白質和可溶性糖等有機成分,為微生物的繁殖提供最初的營養物質,促使微生物大量繁殖,進而加速植物殘體的降解速度,因此產熱越多。堆體在發酵第3天溫度達到最高,高溫導致水分大量蒸發,使堆體整體含水量降低。堆體含水量極大地影響著堆體的通氣狀況(體積質量),進而影響微生物的活性和物料的降解速度。隨著堆制過程的推進,發酵后期有機物被分解,微生物活動分解植物殘體產生的大量H2O因堆體不再高溫而保留,未散發的水分使得堆體含水量升高;與CK相比,CS處理由于其微生物活動旺盛,有機物分解更為徹底,分解過程中釋放更多水分,導致CS處理堆體含水量持續增加;CK處理在第6天堆體溫度已經降到最低 (28.5 ℃),有機物分解速度變慢,有機物分解過程中產生的水分不在增加,但堆體表面水分蒸發不可避免,導致第9天堆體含水率更低。

本研究中體積質量的變化趨勢與Rajpal等[23]的研究結果一致。造成這一現象的原因可能是新鮮蓬松的玉米秸稈變成半分解的有機物料,原有結構被破壞,使原本疏松的結構變得緊實。在本研究中,全氮含量一直呈上升趨勢,這與蘇鵬偉等[24]的研究結果相似,這是由于玉米漿中含有大量含氮物質,礦化作用的速度相對緩慢,氮素揮發損失較少,且隨著培養料中有機物質不斷被分解,干物質含量不斷下降,故造成單位干物質中全氮的相對含量增加。TOC降低和電導率上升與堆體內有機物的降解有關,隨著發酵進程的推進,大量有機物被分解,同時產生大量的無機鹽,導致電導率升高。CS處理銨態氮含量高的原因可能與堆體中含有大量的蛋白質態氮有關,玉米漿中含有大量的可溶性蛋白質態氮、氨基酸和水解酶,在氨化過程中產生大量的銨態氮,銨態氮促進有機氮的轉化,酰胺態氮的作用次之[25],而CK處理外源氮為尿素(酰胺態氮),有機氮降解相對緩慢;堆體pH升高可能與銨態氮的大量釋放有關[26]。

在本次研究中,變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是發酵過程中最豐富的細菌菌群,這與Meng等[27]的研究一致,它們代表總鑒定序列的90%以上的菌群群落。由于玉米漿中含有豐富的營養物質,為微生物的活動提供充足的能源,加速微生物對有機物的降解,導致CS處理比CK處理更早進入高溫期,而放線菌群與厚壁菌群可在高溫環境中具有良好的生存能力,因此CS處理與CK處理相比,能更好的降解木質纖維素。溫度較高可能會導致一部分不耐高溫的微生物失活,進而使CS處理內的微生物的群落多樣性低于CK處理。而CS處理內的pH與CK處理相比,更接近弱堿性,更有利于微生物進行代謝等活動[21]。在前人的研究中曾指出,厚壁菌可在高溫下生長,并廣泛分布于發酵的高溫階段[28],這與本研究的結果相似。CK處理較CS處理堆體具有更多的特異性細菌微生物生物類群。與CK處理相比,CS高溫期的溫度較高,而細菌對于環境的變化很敏感[29],此時CS堆體內嗜溫微生物的活性不斷下降,嗜熱微生物的活性增強,并取代嗜溫微生物成為優勢菌屬,從而導致堆體內微生物多樣性降低[30]。

4 結 論

在大球蓋菇培養料建堆發酵過程中,以玉米漿或尿素作為氮源都會導致堆體溫度上升、體積質量增大、pH升高、碳氮比降低;但與對照相比,添加玉米漿能夠改變發酵堆的理化性質,使發酵溫度上升更高,高溫期更長,電導率和全氮含量升高。使電導率與全氮和銨態氮含量正相關;并改變高溫期細菌群落的相對豐度,在一定程度上促進變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)的生長,同時又抑制擬桿菌門(Bacteroidota)的生長,使具有分解纖維素、固氮功能的菌屬顯著升高成為優勢菌屬,在一定程度上促進氮循環,更有利于秸稈腐熟發酵。這些結果為研究玉米秸稈和玉米漿發酵中優勢屬的潛在功能提供參考。