施加微生物菌劑對馬鈴薯根際土壤細菌多樣性的影響

楊 楠,譚雪蓮,郭天文,3,張平良,劉曉偉

(1.甘肅農業大學 資源與環境學院,蘭州 730070; 2.甘肅省農業科學院 旱地農業研究所,蘭州 730070; 3.甘肅省農業科學院,蘭州 730070)

甘肅省是中國馬鈴薯的主產區,面積和產量均居全國第三位[1]。近年來,規?；图s化的種植模式以及化肥的不合理使用,導致馬鈴薯產量和品質下降、土壤微生物多樣性降低、土壤生態系統失衡等問題日益突出[2],制約甘肅省馬鈴薯產業健康發展。因此,研究新型環保肥料對土壤生態環境具有重要的意義。微生物菌劑作為一種新型環保肥料,含有大量有效活菌,可以分解土壤有機質[3],促進土壤中難溶性養分的溶解和釋放[4-5];此外,這些有效菌在生命活動過程中,能夠分泌植物激素和抗生素等活性物質,刺激作物生長[6];微生物菌劑還含有大量營養成分,其特定的肥料效應能夠提供作物生長所需的營養元素[7]。微生物菌劑具有改善土壤結構[8-9]、提高土壤微生物豐富度[10]、減輕病蟲害[11]等作用,可實現農業的持續發展。前人研究表明,哈茨木霉菌在提高枸杞幼苗成活率的同時,提高了果實內含物多糖、甜菜堿、總黃酮含量和胡蘿卜素[12];施用菌劑可有效降低連作棉田棉花黃萎病的發病率,并增產9.64%～26.21%,緩解連作障礙的同時,顯著降低棉花根系丙二醛的含量,提高根系活力,減輕作物的自毒作用,也可顯著提高連作土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量,較不施菌劑處理分別增加15.4%、36.8%、19.8%[13];復合微生物菌劑與氨基酸水溶肥組合施用顯著提高了香蕉土壤有益菌鞘氨醇單胞菌屬的物種豐度,且顯著降低了土壤致病真菌炭疽菌屬的物種豐度,降低香蕉發病率[14]。目前,微生物菌劑對馬鈴薯土壤微生物多樣性的研究鮮有報道。本研究采用高通量測序對馬鈴薯土壤微生物多樣性進行研究,從微生物生態學的角度探討施用不同劑量微生物菌劑馬鈴薯根際土壤細菌群落組成和多樣性,為土壤可持續發展作理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2020年在甘肅省定西市團結鎮高泉山上進行。該地區位于北緯35°24′21″,東經 104°34′94″,海拔2 155 m,年平均氣溫較低,年平均降水量500～550 mm,屬干旱、半干旱地區。試驗地前茬作物是柴胡,土壤肥力良好,0～20 cm土層的有機質、全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效鉀分別為7.5 g·kg-1、0.73 g·kg-1、0.67 g·kg-1、19.9 g·kg-1、15.12 mg·kg-1、 174.81 mg·kg-1,pH為8.21。

1.2 試驗設計

供試馬鈴薯品種為‘隴薯10號’,試驗所用菌劑為黑沃土酸性微生物顆粒菌劑(有效活菌數≥5 億/g),功能菌為枯草、地衣、解淀粉芽孢桿菌以及哈茨木霉菌等多種復合菌,總養分≥15%( N:10%,P2O5:2%,K2O:3%),定殖率為37.8%,由黑沃土生物科技有限公司提供。大田試驗共設計6個處理,分別為:不施肥對照處理CK;單施化肥對照處理F(N:180 kg·hm-2,P2O5:90 kg·hm-2,K2O:90 kg·hm-2);處理T1(化肥+顆粒菌劑 75 kg·hm-2);處理T2(化肥+顆粒菌劑 150 kg·hm-2);處理T3(化肥+顆粒菌劑225 kg·hm-2);處理T4(化肥+顆粒菌劑300 kg·hm-2),其中施菌劑處理所施用的化肥量均與單施化肥相同,化肥全部一次性在播前基施,黑沃土酸性微生物顆粒菌劑采用穴施。試驗共18個小區,長8 m,寬6 m,面積48 m2,試驗地四周均設有4行保護行。馬鈴薯采用全膜覆蓋壟播栽培,壟高30 cm、行距60 cm、株距30 cm,播種密度:52 500穴·hm-2。試驗于2020年4月20日播種,于10月20日成熟收獲。

1.3 田間管理及樣品采集

播前撒施毒死蜱殺蟲藥75 kg·hm-2,預防蟲害。苗高8～10 cm時結合鋤草適時中耕培土提高地溫,疏松土壤。樣品于2020年8月采集各試驗小區耕層(0～20 cm)土壤新鮮樣品,將植株和周圍的土體取出,輕輕抖落掉根系外圍土,取其表層土壤,將取到的土樣混合均勻,土樣裝到無菌袋密封,放入冰盒帶回實驗室,并在-80 ℃的冰箱儲存,土樣用于后續土壤微生物DNA提取及微生物多樣性分析。

1.4 根際土壤總DNA提取及PCR擴增

土壤樣品利用CTAB方法對基因組DNA進行提取,提取后的DNA使用 Qbiut(廠家 invitrogen,試劑 Qubit TM dsDNA HS Assay Kit)進行濃度檢測,使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整性。PCR擴增采用細菌通用引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)進行擴增,PCR反應用10 μL體系:KOD FX Neo Buffer 5 μL,2 mmol·L-1dNTPs 2 μL,正向引物(10 μmol·L-1)0.3 μL,反向引物(10 μmol·L-1)0.3 μL,KOD FX Neo 0.2 μL,Template DNA 5～50 ng,補ddH2O至10 μL。擴增條件為95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共25個循環,72 ℃延伸7 min,4 ℃保存備用。基于Illumina Novaseq測序平臺構建小片段文庫進行雙末端測序,委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.5 數據分析與處理

高通量測序得到的原始數據通過拼接過濾最后保留高質量序列用于分析,符合的序列進行OTU聚類分析,基于聚類結果進行多樣性分析;分析不同分類水平下土壤細菌在群落結構上的相似性。采用Microsoft Excel 2016對試驗數據進行處理與作圖,采用DPS 9.01進行統計分析,LSD法進行差異顯著性檢驗。使用QIIME2(Version 2020.6)計算Chao1、ACE、Shannon指數,采用基于Binary-Jaccard距離矩陣對細菌群落進行β多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 測序數據質量評估及OTU聚類分析

由表1可知,6個樣品共獲得原始序列 946 008條,通過質控后獲得高質量序列849 727條,有效序列數共797 583條,平均序列長度為 417.67 bp。其中,土壤樣本CK、F、T1、T2、T3、T4分別讀取了142 137、143 102、145 191、 144 629、144 456、130 212條優化序列,T4與其他處理差異顯著。

表1 樣本測序數據統計結果Table 1 Statistical results of sample sequencing data

依據0.97的序列相似性在6個土壤樣本中共檢測出9 939個OTU,每一個OTU被視為一個微生物物種。所有的OTU數量可分為30門、85綱、180目、266科、426屬、463種。各土壤樣本CK、F、T1、T2、T3、T4所含的OTU數分別為1 666、1 657、1 653、1 676、1 656、1 631,其中共有的OTU數為1 558。各處理所含OTU數排序為T2>CK>F>T3>T1>T4,其中F與T2差異顯著,T2較F增加1.15%;隨著菌劑用量的增加,OTU數量呈現出先增加后降低的趨勢,在菌劑用量增加到150 kg·hm-2(T2)時達到最大值,T2與T4差異顯著,較T4增加2.76%。由此表明施用化肥+顆粒菌劑150 kg·hm-2可顯著提高OTU數量。

圖1是相似度在0.97條件下各土壤樣品的稀釋曲線,細菌豐富度稀釋曲線呈現出的趨勢為先升高后趨于平緩,逐漸達到飽和狀態,表明所測的樣品序列很充分,環境中的物種數目不會因為所測序列的增加而一直增加,可以真實的反映樣品中的細菌群落。

圖1 相似度為0.97條件下各土壤樣品的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of each soil sample with similarity of 0.97

2.2 根際土壤細菌的多樣性分析

2.2.1 土壤α多樣性分析 在供試土壤樣品Alpha多樣性指數中,Chao1指數和ACE指數越大表明土壤樣品中細菌的含量越高,土壤菌種的豐富度越高。Shannon指數代表了菌群的多樣性,指數大小與菌群多樣性高低成正比。由表2可知,Chao1指數在各處理中的大小依次為T2>CK>T1>T4>T3>F,與F相比,T2、T3分別增加1.33%、0.11%,兩者間差異顯著;在不同菌劑用量之間,T1與T2差異顯著,T2較T1增加 0.65%。ACE指數排序為T2>CK>T1>F>T3>T4,F與T2有極顯著差異,T2較F增加 1.14%。Shannon指數大小依次表現為F>T2>CK>T4>T1>T3,在不同菌劑用量之間,T2與T3差異顯著,T2較T3增加2.15%,施用菌劑處理與對照無顯著差異。結果表明,較單施化肥,微生物菌劑可以顯著增加土壤細菌的豐富度,尤以菌劑用量為150 kg·hm-2時作用最明顯;與不同菌劑用量相比,菌劑用量為150 kg·hm-2可以提高土壤細菌的多樣性。

表2 不同處理馬鈴薯根際土壤細菌群落多樣性Table 2 Diversity of bacterial community in potato rhizosphere soil under different treatments

2.2.2 土壤β多樣性分析 圖2為OTU水平下采用樣品間jaccard距離矩陣繪制的聚類熱圖,樣品距離熱圖的顏色可以反映樣品間土壤細菌群落結構與多樣性的差異,顏色越藍表示樣品間距離越近,細菌群落相似度越高,越紅則距離越遠。T4與CK、F、T1的土壤細菌群落之間具有差異,其中T4和F、T1的細菌群落之間的差異顯著。說明施用菌劑的用量越高對土壤細菌群落的影響越大。

圖2 OTU水平下土壤細菌距離熱圖Fig.2 Heatmap of soil bacteria distance at OTU level

2.3 根際土壤細菌群落結構多樣性分析

2.3.1 門水平根際土壤細菌群落結構變化 圖3為供試土壤細菌門水平上的分類,其中相對豐度較高的分別是變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)。土壤細菌各處理在組成上沒有區別,但在菌群結構和相對豐度上有一定差異。變形菌門是各供試土壤的優勢菌門(占比為31.40%～34.78%),相對豐度最高,各處理間差異不顯著。放線菌門在土壤中分布較廣,是本研究的第二大優勢菌門,與F相比,T4放線菌門相對豐度增加4.59%,CK、T1、T2、T3分別降低29.19%、17.08%、8.26%、0.77%,其中F與其余各處理均達到顯著水平,且與CK、T1、T2達到極顯著水平,T4放線菌門相對豐度最高,較CK增加35.10%。酸桿菌門菌劑用量為300 kg·hm-2(T4)時土壤菌群豐度最高,在不施肥土壤中豐度最低,與CK相比,T2、T3、T4分別降低27.38%、22.17%、33.24%,兩者之間均有顯著差異,且CK與T4達到極顯著水平;與F相比,T4酸桿菌門相對豐度降低29.33%,兩者差異顯著;隨著菌劑用量增加,酸桿菌門在土壤中的相對豐度呈現先降低再增加后降低的趨勢,菌劑用量增加到300 kg·hm-2(T4)時達到最低值,其中T1與T4差異顯著,T4較T1降低 26.81%。與CK、F相比,T4芽單胞菌門相對豐度分別降低25.16%、 21.01%,兩者之間均有顯著差異,且CK與T4達到極顯著水平;隨著菌劑用量增加,芽單胞菌門在土壤中相對豐度變化趨勢與酸桿菌門相同,T4較T1、T3分別降低21.01%、 17.73%,兩者之間有顯著差異。由此可見,施用微生物菌劑可顯著引起馬鈴薯根際土壤細菌門水平群落組成的變化,較不施肥和單施化肥,施用微生物菌劑會顯著降低酸桿菌門、芽單胞菌門的相對豐度,且以菌劑用量300 kg·hm-2時最為顯著。較單施化肥,菌劑用量為300 kg·hm-2時可以顯著提高放線菌門的相對豐度,其余處理則會降低放線菌門的相對豐度。

圖3 供試土壤細菌門水平分類Fig.3 Classification of bacterial phylum level in tested soil

2.3.2 綱水平根際土壤細菌群落結構變化 由圖4可知,供試土壤細菌在綱水平上主要有α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)、Subgroup_6、放線菌綱(Actinobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、酸微菌綱(Acidimicrobiia)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、母鏈菌綱(Blastocatellia_Subgroup_4)、綠彎菌綱(Chloroflexia)。平均豐度小于1.50%的部分(others)未在圖中顯示。通過細菌群落豐度比例可知,α-變形菌綱(17.54%～19.56%)和γ-變形菌綱 (10.24%～13.62%)在土壤細菌結構中所占比例最大,α-變形菌綱是各處理的優勢菌綱,各處理間差異不顯著。γ-變形菌綱是第二大優勢菌綱,其相對豐度大小依次為:T4>T2>T3>T1>CK>F,與CK相比,T4 γ-變形菌綱相對豐度增加32.04%,兩者有顯著差異。與CK相比,T4芽單胞菌綱相對豐度降低了26.91%,兩者達到極顯著水平;隨著菌劑用量增加,其相對豐度呈現出先降低后增加再降低的趨勢,T2、T3、T4較T1分別降低 14.38%、11.94%、32.45%。與CK、F相比,T3放線菌綱相對豐度分別增加129.11%、 59.48%,T4分別增加169.68%、87.72%,T3、T4和CK、F差異顯著,其中CK和T3、T4達到了極顯著水平;在不同菌劑用量中T3、T4較T1分別增加 93.39%、127.63%,且兩者之間差異顯著。與F相比,T2、T3、T4擬桿菌綱相對豐度分別增加74.19%、73.52%、124.49%,且兩者間達到極顯著水平;與CK相比,T4擬桿菌綱相對豐度增加了59.73%,兩者間有顯著差異;在不同菌劑用量之間,T1與T2、T3、T4有顯著差異,T2、T3、T4較T1分別增加46.80%、46.24%、 89.20%。與F相比,T3、T4酸微菌綱相對豐度分別降低 21.38%、24.04%,兩者間均有顯著差異。與CK相比,T2、T3、T4母鏈菌綱相對豐度分別降低 32.25%、29.20%、38.10%,兩者間均有顯著差異,且CK與T4達到極顯著水平。綠彎菌屬于光合細菌類群,能夠利用光合作用來維持生存。與F相比,T1、T2綠彎菌綱相對豐度分別降低了39.38%、40.45%,兩者間有顯著差異。由此可見,施用微生物菌劑可顯著引起馬鈴薯根際土壤細菌綱水平群落組成的變化,較不施肥,微生物菌劑可以顯著提高γ-變形菌綱相對豐度,可以顯著降低芽單胞菌綱、母鏈菌綱相對豐度,且都以菌劑用量為300 kg·hm-2時最顯著。較單施化肥,微生物菌劑可以顯著降低酸微菌綱、綠彎菌綱相對豐度。較對照,菌劑用量為300 kg·hm-2可以顯著提高放線菌綱和擬桿菌綱相對豐度。

圖4 供試土壤細菌綱水平分類Fig.4 Classification of bacterial class level in tested soil

3 討 論

土壤中大量的細菌會抑制病原菌的生長繁殖,土壤細菌的豐富度與土壤健康息息相關[15]。本研究基于高通量測序平臺Illumina Novaseq對不同用量微生物菌劑的馬鈴薯根際土壤細菌的多樣性進行了分析,結果表明,馬鈴薯施用微生物菌劑后土壤細菌多樣性發生顯著變化,單施化肥與菌劑用量為150 kg·hm-2兩者差異顯著,說明施用菌劑可以顯著增加土壤細菌的Chao1指數和ACE指數。前人研究結果也證明,復合木霉菌菌劑處理后的小麥根際土壤細菌Shannon指數及Chao1指數顯著增加[16];枯草芽胞桿菌菌肥會在一定程度上提高土壤細菌種群多樣性,使土壤細菌群落結構更加豐富[17];黃腐酸與微生物菌劑協同處理后可顯著提高煙草根際土壤細菌群落Shannon指數和辛普森指數,有效改善了根際土壤細菌的生態環境[18]。

在門、綱水平上,馬鈴薯根際土壤的優勢菌門有變形菌門、放線菌門、酸桿菌門,本研究中變形菌門是存在于土壤中最為廣泛的優勢菌門,此結果與前人研究結果一致[19-24]。主要原因可能是微生物菌劑的施用影響了原有土壤微生物菌群結構,并形成了一種特定的微生態環境。本研究表明,在單施化肥的基礎上,增施300 kg·hm-2的微生物菌劑可顯著增加有益菌群放線菌門相對豐度,這與前人研究結果一致[25]。放線菌具有解磷固氮的作用,其代謝產物中產生的一些物質不僅對病原菌有拮抗作用[26],還可以降解一些有毒有害物質[27-28],說明微生物菌劑會明顯減輕病原菌和有害物質對土壤的侵害,使土壤生態系統向著健康的方向發展。酸桿菌門是本研究中的第三大優勢菌門,酸桿菌門適宜在較貧瘠的土壤上生存[29],其相對豐度與土壤肥力成反比,可以作為土壤養分狀況的指示菌[30]。本研究中不施肥處理中酸桿菌門的相對豐度最低,單施化肥次之,而菌劑用量為300 kg·hm-2相對豐度最高,說明微生物菌劑可以有效活化土壤養分、提高土壤肥力。綱水平上,本研究發現,較不施肥,菌劑用量為300 kg·hm-2會顯著提高γ-變形菌綱的相對豐度,這與李金花等[31]、譚雪蓮[32]的研究結果相反,原因可能是菌劑用量為300 kg·hm-2的土壤處于高營養狀態,γ-變形菌綱在土壤養分含量較高的環境中含量豐富,且含有一些優勢菌,例如:氨氧化細菌,說明高養分含量對γ-變形菌綱的相對豐度有促進作用。此外,研究發現較不施肥與單施化肥,施用菌劑也會顯著提高擬桿菌綱、放線菌綱的相對豐度。擬桿菌具有溶磷作用,其相對豐度和速效磷含量成正比[25],擬桿菌不僅對土壤有機碳轉化為無機碳的過程起到重要作用[30],而且還可以分解高分子物質達到降解的目的[33]。酸微菌綱、放線菌綱均屬于放線菌門,以往研究表明,放線菌綱對增加土壤有機碳、氮磷比、碳氮比上有極顯著的作用,但會降低土壤pH,而酸微菌綱與土壤pH呈顯著正相關關系[34],本研究供試土壤為堿性土壤,施用菌劑使酸微菌綱顯著降低,說明菌劑有中和土壤酸堿度的作用,放線菌綱在施用菌劑后顯著增加,說明施用菌劑會促進土壤營養元素的流動,這與前人研究結果一致[35]。本研究中菌劑用量為300 kg·hm-2較不施肥會顯著降低芽單胞菌綱的相對豐度,這與前人研究結果一致[14,36]。芽單胞菌綱中含有很多病原菌,如腸桿菌科、假單胞菌科,說明菌劑可以通過降低芽單胞菌綱的相對豐度,從而降低馬鈴薯的發病幾率。

4 結 論

較單施化肥,菌劑用量為150 kg·hm-2時會顯著提高土壤細菌OTU數量和豐富度。施用微生物菌劑對土壤細菌結構有很大的影響,與對照相比,菌劑用量為300 kg·hm-2時可以顯著降低酸桿菌門、芽單胞菌門相對豐度,顯著提高放線菌綱、擬桿菌綱相對豐度;較單施化肥,菌劑用量為300 kg·hm-2時可以顯著提高放線菌門的相對豐度,顯著降低酸微菌綱相對豐度;較不施肥,菌劑用量為300 kg·hm-2時可顯著提高γ-變形菌綱相對豐度,降低芽單胞菌綱相對豐度。微生物菌劑顯著改善了土壤細菌菌群結構,增加了有益菌的豐度,進而改善了馬鈴薯土壤微環境。