云杉葉枯病新病原的鑒定及其生物學特性測定

李柘柘,崔凌霄,魏立娟,金夢軍,馬 婷,楊成德

(甘肅農業大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室,蘭州 730070)

云杉(Piceaasperata)是中國特有的云杉屬森林樹種[1],為高大常綠喬木,多在山地形成水源涵養林[2],是北方針葉林的特征種。云杉屬植物可用作建筑、樂器和造紙等[3-5],也是很受歡迎的綠化和園藝觀賞樹木[6]。然而,云杉病害降低了云杉的經濟和生態價值。云杉育苗期的病害主要有立枯病(Rhizoctoniasolani)、灰霉病(Botrytiscinerea)和雪枯病(Lophophacidiumhyperboreum);成林云杉的病害主要有葉銹病(Chrysomyxaspp.)、葉疫病(Rhizosphaerakalkhoffii)、球果銹病(Thekopsoraareolata)和立木腐朽病(Trametespubescens)。

云杉葉枯病是一種葉部病害,植株被感染后針葉枯萎,造成巨大的經濟損失。袁自清[7]報道了一種云杉葉枯病癥狀,受感染針葉褪綠變枯黃色,枯死后不脫落,枯死的針葉上埋生有黑色小點;在江西省發現針葉上出現褐色病斑的葉枯病[8],病斑周圍有半透明環帶,老葉上病斑顏色比新葉要深;Janosikova-Heckova等[9]觀察到一種云杉葉枯病癥狀,被侵染的針葉上有紅色或棕色條帶,針頭枯死呈紅棕色,針葉上有黑色的子實體。2020年在甘肅省天水市調查時,發現一種癥狀與已報道略有差別的云杉葉枯病,發病部位呈深黃色,病健交界處呈黑色,病斑逐漸向外擴展,最后整片針葉變黃脫落。枯死針葉表面出現黑點,濕度大時葉基部和枝條被白色菌絲層覆蓋(圖1-A)。因此,本試驗對其進行了病原菌分離、鑒定、致病性和生物學特性測定,以期為云杉葉枯病的診斷和科學防控提供理論依據。

A.從森林中采集的云杉病葉;B.用菌株SJ1接種離體枝條針葉的癥狀;C.用無菌水接種離體枝條針葉的對照;D.用菌株SJ1接種活體枝條針葉出現癥狀;E.用無菌水接種活體枝條針葉的對照

1 材料與方法

1.1 云杉葉枯病菌的分離與致病性測定

采用組織分離法對收集自甘肅省天水市林區具有典型葉枯病癥狀的云杉針葉進行分離,從病健交界處切下長1 cm的針葉組織,用75%的乙醇消毒30 s,用無菌水沖洗3次后在無菌濾紙上干燥,然后將它們置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上,25 ℃避光培養3～5 d,經單菌落分離純化后, 4 ℃儲存,備用。

通過柯赫氏法則進行致病性測定。先用接種離體植物的方法進行致病性試驗[10]。用75%的乙醇對離體健康的枝條進行消毒,無菌水洗滌,風干后使用。將枝條放置在覆蓋有兩張無菌濾紙的培養皿中,樹枝柄部用無菌棉包裹,濾紙和無菌棉用無菌水保持濕潤。每個處理和對照都在單獨的樹枝上和培養皿中進行,接種前用無菌昆蟲針輕輕刺破每個針葉的角質層,將培養5 d的分離物菌絲或孢子懸浮液噴灑在刺破的針葉上,對照噴灑無菌水。所有接種和對照處理在25 ℃的培養箱中12 h光照和12 h黑暗交替培養,觀察發病情況,葉枯病出現后重新分離,3次重復。對離體樹枝上針葉造成葉枯病的分離物用相同的方法接種于活體云杉上再次進行致病性測定,同樣每個處理和對照都在單獨的樹枝上進行,噴撒懸浮液和無菌水后用塑料袋保濕48 h[11],觀察發病情況并進行再分離,重復3次。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1 形態學鑒定 將菌株接到PDA培養基中心,25 ℃避光培養,觀察菌落形態和色素顏色,然后在光學顯微鏡下觀察分生孢子的形狀和大小,至少隨機選擇50個分生孢子測量大小。

1.2.2 分子生物學鑒定 按公司說明書使用HP真菌DNA試劑盒D3195(Omega Bio-Tek,中國)提取病原菌基因組DNA,DNA樣品于 -20 ℃保存,備用。使用核糖體RNA序列(ITS)、β-微管蛋白(TUB2)基因[12]和RNA聚合酶Ⅱ第2大亞基(RPB2)基因[13]進行PCR擴增。PCR在含有1 μL DNA模板、上下游引物各 1 μL、12.5 μL 2×Easy-TaqPCR Super Mix(中國天啟基因生物技術有限公司)、9.5 μL ddH2O2的25 μL反應體系中進行。擴增引物如表1所示,引物由天啟基因生物技術有限公司合成。

ITS基因序列的擴增程序為95 ℃預變性3 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min,30個循環,72 ℃延伸10 min。TUB2基因序列的擴增程序為94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,34個循環,72 ℃延伸7 min。RPB2基因序列的擴增程序為94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環,72 ℃延伸 2 min。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送天啟基因生物技術有限公司進行測序。測序結果與NCBI核苷酸數據庫中的已知序列進行BLAST比對,并下載已知的同源序列。將測序結果提交至GenBank獲取登錄號。采用MEGA 7.0中的鄰接法構建系統發育樹,并進行1 000次bootstrap測試,計算系統發育樹中節點的置信度。

1.3 病原菌生物學特性測定

1.3.1 供試培養基 參考董漢松[14]的方法,配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基、虎紅瓊脂(rose bengal agar,RBA)培養基、胡蘿卜瓊脂(carrot agar,CA)培養基、馬鈴薯蔗糖瓊脂(potato sucrose agar,PSA)培養基、麥芽浸粉瓊脂(malt extract agar,MEA)培養基、察氏(Czapek agar,CZA)培養基、水瓊脂(water agar,WA)培養基、馬鈴薯胡蘿卜瓊脂(potato carrot agar,PCA)培養基和燕麥片瓊脂(oatmeal agar,OMA)培養基。

1.3.2 培養基對菌絲生長的影響 配制9種供試培養基。用直徑為0.5 cm的無菌打孔器取供試菌株的菌餅,接入到培養基中央,再放入培養箱,25 ℃黑暗培養6 d,重復3次。用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.3 溫度對菌絲生長的影響 溫度條件為5、10、15、20、25、30、35和40 ℃,將菌餅接入最適培養基中央,培養箱中黑暗培養6 d,其他同“1.3.2”。

1.3.4 pH對菌絲生長的影響 用0.1 mol/L的NaOH和HCl調pH,選擇4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0共8個梯度,將菌餅接入不同pH的最適培養基中央,25 ℃黑暗培養6 d,其他同“1.3.2”。

1.3.5 光照對菌絲生長的影響 將病原菌菌餅接入到最適培養基中央,分別在12 h光照和12 h黑暗交替、全光照和全黑暗的培養箱中25 ℃恒溫培養6 d,其他同“1.3.2”。

1.3.6 碳、氮源對菌絲生長的影響 以CZA培養基為基礎培養基和對照,替換其中的碳、氮源。供試碳源為:蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、木糖、果糖、阿拉伯糖和乳糖。氮源為:硝酸鈉、蛋白胨、甘氨酸、脯氨酸、氯化銨、硫酸銨、尿素、亮氨酸、硝酸銨和苯丙氨酸。制作不同的碳、氮源培養基(對照的碳、氮源為蔗糖和硝酸鈉),將病原菌接入到培養基中央,25 ℃黑暗培養6 d,其他同“1.3.2”。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離和致病性測定

根據菌落形態,獲得5株真菌分離物,編號為SJ1-SJ5。通過將菌絲體懸浮液(來自培養5 d的分離物SJ1)和分生孢子懸浮液(每毫升含106個分生孢子,來自培養5 d的分離物SJ2-SJ5)噴灑在離體枝條的針葉上來進行接種。在7 d內,只有接種了SJ1的針葉表現出與最初從森林中采集的樣本相似的癥狀,而對照和接種其他分離物的針葉不發病(圖1-B,1-C)。接種SJ1的針葉在活體植株上7 d內出現上述典型癥狀,針葉上出現病斑,之后逐漸擴展,針葉變黃和枯萎,最終從樹上脫落,對照不發病(圖1-D,1-E)。從接種后發病的針葉中重新分離,得到與菌株SJ1菌落特征相同的分離物,證實SJ1是云杉葉枯病的病原物。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態學鑒定 將SJ1在PDA培養基上培養,初期菌絲呈白色絮狀,然后由紅橙色變為深黃褐色,培養后期出現氣生菌絲,菌落表面出現紅黑色液滴,背面為紅橙色(圖2-A,2-B)。分生孢子黑色,扁圓形或近球形,表面有褶皺,未成熟的分生孢子有淡色的柄細胞,大小為12.10 μm～ 28.82 μm×11.58 μm～16.66 μm(n=50)(圖2-C)。

A.菌落正面;B.菌落反面;C.分生孢子(標尺=20 μm)

2.2.2 分子生物學鑒定 提取SJ1的基因組DNA,用引物擴增核糖體RNA序列(ITS)、β-微管蛋白(TUB2)和RNA聚合酶Ⅱ第2大亞基 (RPB2)基因,分別得到大小為545、347和939 bp的基因片段,所得序列上傳至GenBank中(登錄號 MW725153、MW751459 和 MW788323)。

在與GenBank中的序列進行BLAST比較后構建系統發育樹,SJ1的ITS、TUB2和RPB2的基因序列與黑附球菌Epicoccumnigrum(GenBank登錄號 MW227323、 MW186822和MW186823)的基因序列同源性分別為100%、 98.36%和99.79%,使用MEGA 7.0鄰接法對3個基因聯合進行系統發育分析,發現菌株SJ1與菌株E.nigrum聚在一起(圖3)。根據形態學[15]和分子生物學特征,SJ1被鑒定為黑附球菌(Epicoccumnigrum)。

圖3 菌株SJ1基于 ITS、 TUB2和 RPB2基因聯合構建的多位點系統發育樹Fig.3 Multilocus phylogenetic tree constructed with ITS, TUB2 and RPB2 genes of strain SJ1

2.3 生物學特性

2.3.1 培養基對菌絲生長的影響 黑附球菌SJ1在9種供試培養基上均能生長,最適菌絲生長的為MEA培養基,菌落直徑達5.78 cm,顯著大于其他培養條件(P<0.05),而在CZA培養基上生長最慢,菌落直徑僅3.57 cm。在PCA和OMA培養基上氣生菌絲較稀疏,在WA培養基上基本不生長,而在其余培養基上氣生菌絲生長繁茂(圖4)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.3.2 溫度對菌絲生長的影響 黑附球菌SJ1在10到30 ℃下均能生長且氣生菌絲繁茂,在 35 ℃下基本不生長,而在5 ℃和40 ℃時菌落不生長。從10 ℃到25 ℃,菌落直徑逐漸增大,在25 ℃時菌落直徑顯著大于其他溫度條件(P< 0.05),從25 ℃到30 ℃,菌落直徑減小,說明 25 ℃為菌絲最適生長溫度(圖5)。

圖5 SJ1菌絲在不同溫度的生長情況Fig.5 Effect of temperature on mycelial growth of E.nigrum SJ1

2.3.3 pH對菌絲生長的影響 黑附球菌SJ1在pH為4到11范圍內均能生長且氣生菌絲繁茂。pH為4時生長最慢,菌落直徑為5.68 cm。pH由4到7時,菌落直徑逐漸變大,在pH為7時菌落直徑最大,菌落直徑達6.95 cm,pH由7到11時,菌落直徑逐漸變小。說明在過酸和過堿條件菌絲生長均會受到抑制(圖6)。

圖6 不同pH下SJ1菌絲的生長Fig.6 Effect of pH on mycelial growth of E.nigrum SJ1

2.3.4 光照對菌絲生長的影響 黑附球菌SJ1在不同光照下均能生長且氣生菌絲繁茂,12 h光照和12 h黑暗交替培養條件最適菌絲生長,菌落直徑達5.63 cm,全黑暗條件下菌絲生長最慢,菌落直徑為5.27 cm。各光照條件下差異不顯著(圖7)。

圖7 SJ1菌絲在不同光照處理的生長狀況Fig.7 Effect of light on mycelial growth of E.nigrum SJ1

2.3.5 碳源對菌絲生長的影響 黑附球菌SJ1在不同碳源下均能生長,但碳源為乳糖和淀粉時氣生菌絲較稀疏,為其余碳源時氣生菌絲繁茂;碳源為淀粉時菌絲生長最快,菌落直徑達 5.12 cm,為麥芽糖時生長最慢,菌落直徑僅3.90 cm,除麥芽糖外的其余碳源均對菌絲生長有促進作用 (圖8)。

圖8 不同碳源下SJ1菌絲的生長Fig.8 Effect of carbon source on mycelial growth of E.nigrum SJ1

2.3.6 氮源對菌絲生長的影響 黑附球菌SJ1在氮源為尿素時不生長,其余氮源條件下均能生長,但氮源為亮氨酸和蛋白胨時氣生菌絲較稀疏,為其余氮源時氣生菌絲繁茂;氮源為蛋白胨時生長最快,菌落直徑達5.15 cm,且與對照差異顯著(P<0.05),除氮源為蛋白胨外,其余氮源均對菌絲有抑制作用(圖9)。

圖9 不同氮源下SJ1菌絲的生長Fig.9 Effect of nitrogen source on mycelial growth of E.nigrum SJ1

3 討論與結論

葉枯病導致云杉針葉的枯萎和病變,在本研究中發現一種新的云杉葉枯病病害,通過形態學和多位點序列分析,結合柯赫氏法則驗證,最終確定云杉葉枯病的病原菌為黑附球菌。袁自清[7]發現云杉巴氏腔孢(Barriapiceae)可引起云杉葉枯病,在江西省報道了一種由杉木假單孢桿菌(Pseudomonascunninghamiaesp.nov.)引起的葉枯病[8],Janosikova-Heckova等[9]觀察到的云杉葉枯病是由Dothistromaseptosporum引起的,由黑附球菌造成的云杉葉枯病為首次報道。

黑附球菌多分布于空氣和土壤中,其代謝產物有抗菌和抗生物膜活性作用[16],但其也可引起茶樹褐斑病[17]、水稻穗褐變病[18]和豇豆葉斑病[19]等植物病害,而作為一種危害云杉的新病原,研究其生物學特性對其防治有著重要意義。SJ1在PDA培養基上培養后期菌落中央呈黃褐色,菌落形態與引起水稻穗褐變病的黑附球菌落相似[18],而王俊麗等[20]從火龍果莖中分離得到的黑附球菌落中央呈淺黃白色,這可能與病原菌寄主不同有關。本研究發現黑附球菌菌絲可有效利用多種碳、氮源,最適碳源為淀粉,與Beverly等[21]的研究結果一致,最適氮源為蛋白胨,碳源為麥芽糖時生長最慢,而在氮源為尿素時不生長,這為其防治提供了有益的思路。

本研究對云杉葉枯病病原進行了分離、鑒定和生物學特性測定,為云杉葉枯病的診斷和防治提供技術參考。但作為新病害,其流行規律、致病機制及綜合防治方法等還需進一步研究。