陜西省西洋參根結線蟲病的發生和病原鑒定

耿英杰,陳德經,商文靜

(1.西北農林科技大學 植物保護學院,農業部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室,陜西楊凌 712100;2.秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室,陜西理工大學 生物科學與工程學院,陜西漢中 723001)

根結線蟲(Meloidogynespp.)是世界上危害最嚴重的植物病原線蟲之一,其寄主范圍極為廣泛,且為害過程中易與其他病原物發生交互影響,從而加劇危害,世界范圍每年因此造成的經濟損失超過數十億美元[1-2]。根結線蟲種類繁多,現已報道的世界范圍有效種有89個,中國現有根結線蟲有效種39個[3-4]。在已報道的根結線蟲種類中,分布最為普遍,危害最為嚴重的有南方根結線蟲(M.incognita)、北方根結線蟲(M.hapla)、花生根結線蟲(M.avenaria)以及爪哇根結線蟲(M.javanica),數量占總群體數量的95%以上,且在中國均有分布[2,5]。

西洋參(PanaxquinquefoliumL.)也稱花旗參,是五加科人參屬多年生草本植物,原產于加拿大與美國。中國于1975年進行生產性引種后,逐漸形成吉林省撫松縣、山東省文登市和陜西省留壩縣三大主要西洋參優勢栽培區,目前中國已經成為世界西洋參第一大消費國和第二大生產國[6-8],特別是2021年西洋參進入藥食同源的名貴作物序列試點后,其市場需求量將會進一步提高。西洋參的根、莖、葉和果實均可入藥,性寒、味甘微苦,具有補氣養陰、清熱去津、保護心臟、降血糖、降血脂、增強免疫功能和記憶、抑制血小板凝集、抗疲勞、抗休克、抗缺氧等功效,具有極高的藥用和保健價值[9]。西洋參為典型的收根植物,在長達4～5a的生長發育過程中,土傳病害的發生和危害尤為嚴重,特別是西洋參根結線蟲病的發生,不但直接影響西洋參參根的產量和品質,同時加重西洋參根腐病、銹腐病和菌核病等多種病害的危害,增加防治難度和成本[10-13]。

2019年,陜西省漢中市留壩縣西洋參產區普遍出現西洋參地上部植株生長勢衰弱,葉片褪綠變黃且失水凋零,莖稈瘦弱黃化易折等現象。經多次現場踏查發現,罹病西洋參根部具有大量肉眼可見的結節,尤以須根部明顯,部分地塊發生嚴重,根部結節率為100%,初步判定該病為西洋參根結線蟲病。西洋參生產和加工是留壩縣支柱產業,也是當地農戶脫貧致富的主要途徑,基于根結線蟲病對西洋參產量和品質的潛在威脅,加之不同種類的根結線蟲對不同作物的種類或品種具有較強專化性,故準確鑒定病原種類、明確田間根結線蟲優勢種對預防和防治根結線蟲病具有重要意義。因此,2020年至2021年筆者對留壩縣西洋參根結線蟲病作了系統調查,并采集樣本進行室內鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年7月至2021年10月,多次對陜西省留壩縣西洋參種植區不同地塊西洋參根結線蟲病進行調查,記錄發病情況。隨機采取帶根結病根及根際5～15 cm深處土壤共同裝袋,記錄采樣時間、地點等信息并編號。

1.2 西洋參根結線蟲的分離與保存

去除病根表面土粒雜物,置于適量無菌水中,體視顯微鏡下用眼科手術刀與鑷子挑取根結表面乳白色梨形雌蟲、雄蟲和卵囊,卵囊用1%的次氯酸鈉消毒,用無菌水漂凈,置于裝有50 μL無菌水的1.5 mL離心管中,25 ℃光照培養箱內孵化 72 h,得到2齡幼蟲,雄蟲和2齡幼蟲在60～ 65 ℃水浴鍋內溫熱殺死,4%甲醛溶液固定用于形態學鑒定。采用貝爾曼漏斗法分離、富集樣品土壤中線蟲,單卵囊接種番茄植株根部進行純化、擴繁用以分子鑒定及回接。

1.3 線蟲形態觀察

雌蟲形態觀察參考方中達[14]方法并加以改良。挑取20頭雌蟲分別置于體積分數為45%的乳酸中,用眼科手術刀切下雌蟲尾端后部約1/4處,使其切口向下,輕輕地按壓去除尾端組織內容物,轉移至純甘油滴中,使其表面朝上,用眼科手術刀修整至會陰花紋部分平整制片,在顯微鏡下觀察、拍照及記錄形態特征。觀察2齡幼蟲形態,記錄頭部特征、口針特征,測量體長、最大體寬、口針長和DEGO(背食道腺開口至口針基部球的距離)等形態指標,每樣品測量不少于20頭,數值用以統計分析。

1.4 西洋參根結線蟲的分子生物學鑒定

1.4.1 DNA提取 采用微量提取法,參照王江嶺等[15]的方法稍作修改提取樣本DNA。挑取ddH2O清洗后的單頭供試線蟲雌蟲于200 μL PCR管中,加入8 μL ddH2O與1 μL 10×PCR Buffer(Mg2+free),用眼科手術刀將管中雌蟲破碎,瞬時離心后置于液氮1 min,85 ℃加熱2 min,重復4次。加入1 μL蛋白酶K(1 mg/mL), 58 ℃加熱1 h,95 ℃加熱10 min,得到樣品DNA用于進行PCR擴增。

1.4.2 病原線蟲rDNA-ITS序列的擴增 采用根結線蟲ITS擴增通用引物[16](V5367:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′和26S:5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)以及北方根結線蟲特異性引物[17](Mh-F:5′-CGAATAGTCTCAACGTTTATC-3′和Mh-R:5′-ATGTGACAGCGAAAAGAATT-3′)進行供試根結線蟲rDNA的ITS序列特異性PCR擴增,引物均委托北京擎科生物技術有限公司西安分公司合成。25 μL PCR擴增反應體系:12.5 μL PrimeSTAR Max Premix(2×),上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2 μL DNA模板,8.5 μL dd H2O。PCR反應條件為:95 ℃預變性3 min;98 ℃變性10 s,56 ℃或53 ℃退火15 s(引物18S/26S退火溫度56 ℃,引物Mh-F/Mh-R退火溫度為53 ℃),72 ℃延伸30 s,35個循環;最后72 ℃延伸5 min。16 ℃保存,備用。用1×TAE作為電泳緩沖液,PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠130 V電泳20 min,凝膠成像系統觀察、拍照。PCR產物由DNA膠回收試劑盒(Magen)回收、純化,具體操作步驟參照試劑盒操作說明。

1.4.3 rDNA-ITS序列的克隆、測序及數據分析 將純化后的PCR產物克隆至質粒載體pEASY○R-Blunt Zero Cloning Vector上,選取2個陽性克隆委托北京擎科生物技術有限公司西安分公司測序。測序結果登錄NCBI進行BLAST比對分析,以秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)(X03680)的ITS序列作為外群。利用MEGA7.0軟件通過最大似然法(Maximum likelihood)構建系統發育樹,分析樣品親緣關系。構建的系統發育樹作自展檢驗(Bootstrap)以獲得分支的支持率,自展檢驗中重復抽樣次數為1 000次。

1.5 線蟲致病性檢測

前期擴繁、純化得到的西洋參根結線蟲二齡幼蟲用于回接,接種濃度為1 000 頭/mL,接種方法采用灌根法,無菌水接種為對照,接種植物材料為沙培健康3 a生西洋參植株。接種后連續觀察,記錄發病情況,對發病植株上的根結線蟲進行再分離與鑒定。

2 結果與分析

2.1 西洋參根結線蟲癥狀及發病情況

田間觀察及室內回接結果表明,根結線蟲侵染西洋參后,植株地上部長勢衰弱矮小,葉片萎蔫,發黃褪綠(圖1-A～1-D);根部膨大形成根,根結大小不等且多發生在支根和須根上(圖1-E,1-F),侵染嚴重時根結呈念珠狀,后融合在一起形成較大根結,大量乳白色到淺褐色卵囊暴露在根結表面(圖2-A);將帶根結的支根剪斷,用水洗凈表面土粒,在體視顯微鏡下可以觀察到埋藏在根部表皮中的雌蟲和雄蟲,剖開卵囊可以觀察到卵圓形透明蟲卵(圖2-B)。

根結線蟲病為典型土傳病害,病原以卵囊、成蟲在田間土壤、病殘體上越冬,加之西洋參為宿根植物,田間種植期達4～5 a,目前生產上缺乏對根結線蟲病發生規律的了解,也缺乏針對性防治措施,該病存在進一步加重和蔓延趨勢。

A.健康西洋參田塊;B.受西洋參根結線蟲危害田塊;C.健康西洋參植株地上部分;D.受根結線蟲危害的西洋參地上部分;E、F.帶有根結的西洋參根部;G.受根結線蟲危害西洋參根部;H.健康西洋參根部

A.西洋參根結線蟲卵;B.西洋參根結線蟲單卵塊;C.西洋參根結線蟲雌蟲;D.西洋參根結線蟲雌蟲會陰花紋;E.西洋參根結線蟲二齡幼蟲;F.二齡幼蟲尾部;G.二齡幼蟲頭部

2.2 西洋參根結線蟲形態學鑒定

線蟲形態觀察結果表明,西洋參根結線蟲卵囊淺褐色到白色,附著在西洋參根表皮外,卵橢圓形,無色透明(圖2-A,2-B);二齡幼蟲體長329.10～427.87 μm,頭部鈍圓光滑,尾部尖細;口針明顯,長9.59～13.41 μm,口針基部球小而圓,背食道腺開口到口針基部球距離(DEOG)為3.28～4.12 μm;尾尖鈍圓有明顯透明區,長度為47.77～67.63 μm(圖2-E～2-G,表1);雌蟲蟲體梨形或近橢圓形,白色或乳白色,頸短不明顯;口針發達,口針桿部后部稍寬,口針基部球較小,有縊縮,近圓形(圖2-C);雌成蟲會陰花紋整體外觀呈近圓形,背弓較為低平,線紋平滑至波浪狀,側區一側或兩側延伸形成翼狀,部分樣本背腹線在側線處相交,但無明顯側線,尾端區有刻點(圖2-D)。根據以上形態特征,參照文獻[18]初步鑒定西洋參根結線蟲為北方根結線蟲。

2.3 西洋參根結線蟲分子生物學鑒定

利用根結線蟲ITS通用引物V5367和26S對西洋參根結線蟲的rDNA-ITS區域進行PCR擴增,擴增產物經回收、克隆與序列測定,得到768 bp大小的目的片段。測序結果登錄GeneBank(MW019969.1與MT951634.1)進行BLAST比對,結果顯示,供試根結線蟲ITS序列與北方根結線蟲(MT249016.1與KJ572385.1)相似,相似度達100%。

基于ITS序列利用MEGA7.0軟件中的Maximum likelihood法構建系統發育樹(圖3),結果顯示,供試西洋參根結線蟲(4-1,4-2)與北方根結線蟲位于同一分支,支持率為100%,同時與其他常見根結線蟲明顯區分開,分支間系統發育關系清晰。使用北方根結線蟲特異性引物Mh-F與Mh-R對樣品DNA進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約462 bp大小的片段(圖4),與馮光泉等[17]描述一致,表明西洋參根結線蟲為北方根結線蟲。

圖3 基于rDNA-ITS序列構建的樣品西洋參根結線蟲系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of root-knot nematodes on Panax quinquefolium based on rDNA-ITS fragment sequences

M.DL 5000;1-4.西洋參根結線蟲;CK.陰性對照

A.接種后發病植株;B.健康對照;C.回接發病植株根結

以上形態學特征以及ITS系統發育樹以及特異性擴增產物等分子生物學鑒定結果表明,在陜西省留壩縣發生的西洋參根結線蟲病病原為北方根結線蟲(Meloidogynehapla)。

2.4 西洋參根結線蟲致病力檢測

回接檢測結果表明,接種4周后,病株地上部分出現部分長勢衰弱,植株矮小,葉片褪綠變黃(圖 5-A)。參根上須根減少,且出現明顯根結(圖 5-C),從根結上分離出根結線蟲經鑒定為M.hapla。

3 結論與討論

針對近年來陜西留壩縣西洋參根結線蟲病的發生情況,本研究采用田間調查結合實驗室分析的方法,對該病進行了系統研究。結果表明,當地西洋參根結線蟲病發生較為普遍,2020年至2021年田間發病率達40%～60%,且有進一步蔓延加重趨勢。同時,利用形態學鑒定結合分子生物學方法,對采集自陜西省留壩縣西洋參種植區的西洋參根結線蟲病樣品進行了病原鑒定。鑒定結果表明,侵染當地西洋參的根結線蟲為北方根結線蟲,鑒定結果準確可靠。北方根結線蟲是分布最廣泛的根結線蟲之一,是冷涼作物產區最主要的植物病原線蟲,主要分布在北緯34°～43°及南緯45°以南的低海拔地區[19]。在中國內蒙古、遼寧、山東、安徽、福建、云南、河南、江蘇、河北、北京、吉林、山西、陜西等地均有北方根結線蟲發生危害的報道[20-23]。北方根結線蟲寄主廣泛,是經濟作物根結線蟲病的主要病原之一,目前,國內報道的人參屬藥用植物,如人參、三七等根結線蟲病的病原均為北方根結線蟲[17,23-24]。1997年,莫明和等[21]報道北方根結線蟲可以侵染西洋參引起根結線蟲病,但受當時鑒定技術的局限,仍缺乏科學的鑒定證據。由于北方根結線蟲對不同作物的種類或品種具有較強專化性,故準確鑒定病原種類、明確田間為害根結線蟲優勢種對預防和防治根結線蟲病具有重要意義。

目前,國內外研究者普遍采用形態學特征結合分子生物學方法對根結線蟲進行分類鑒定[25-26],擺脫了單純依賴雌蟲會陰花紋特征的局限,大大提高了鑒定結果的準確性和可靠性。本研究中,供試根結線蟲的會陰花紋尾區有明顯的刻點結構,與謝輝[18]描述的北方根結線蟲會陰花紋特征相似,且2齡幼蟲指標的測量值均與北方根結線蟲相應指標相符,但形態鑒定對研究者的操作技能與經驗有較高要求,且根結線蟲雌蟲會陰花紋存在一定程度的種內變異而不精確,因此,本研究利用分子生物學方法,結合rDNA-ITS序列特異性PCR擴增及系統發育樹構建,進一步明確鑒定西洋參的根結線蟲病病原為北方根結線蟲,鑒定結果準確、可靠。

西洋參從栽培到收獲至少需要生長3～5 a,由于栽培時間過長,使得其根系長期暴露于各種土壤環境中病原物的威脅下,特別是西洋參根結線蟲病地上部癥狀不典型,在西洋參栽培過程中很難及時發現并采取措施,且根結線蟲蟲體小,群體增加速度快,可能導致土壤中根結線蟲的蟲口密度的迅速累積,分布面積急劇擴大,對西洋參連作或后茬作物種植具有極大的潛在威脅,可能成為西洋參連作障礙形成的又一重要原因。因此,準確鑒定病原種類、研發快速鑒定技術以及篩選低毒高效的防治藥劑,可以為預防和防治西洋參根結線蟲病以及消減西洋參連作障礙提供必要的技術支撐。