陜西黃瓜靶斑病菌鑒定及藥劑毒力測定

李新陽,李 敏,劉海龍,羅楨彬,王 陽,馬 青

(1.西北農林科技大學 植物保護學院,陜西楊凌 712100;2.陜西省銅川市蔬菜技術推廣站,陜西銅川 727000;3.陜西省甘泉縣蔬菜技術服務中心,陜西甘泉 716100)

黃瓜靶斑病俗稱黃點子病,又稱褐斑病。由多主棒孢霉(Corynesporacassiicola)引起,主要危害黃瓜葉片,發生嚴重時危害莖蔓、葉柄。多主棒孢霉寄主范圍廣,可侵染包括橡膠、番茄、大豆等380個屬內530種植物[1]。多主棒孢霉以分生孢子隨病殘體、雜草在土壤中或寄主上越冬,或以菌核、厚垣孢子形式越冬,適宜溫度下產生分生孢子;翌年,病菌通過氣流、雨水飛濺傳播后完成初侵染,潛伏期約一周,后形成新的分生孢子進行多次再侵染,擴散迅速。黃瓜靶斑病的病情消長與溫室內小氣候的變化呈顯著的相關關系,尤其病原菌可在保護地內安全越夏的情況下,導致保護地內黃瓜靶斑病多年持續發生[2-3]。該病發生于盛瓜期,有時苗期也可發生,通常中部葉片最先發病,后逐漸向下部擴展,常造成減產20%以上,重則達到70%,甚至絕收,嚴重影響黃瓜的品質與產量[4-5]。本研究采用生長速率法[6]測定10種殺菌劑對黃瓜靶斑病菌的室內毒力效果,研究多種藥劑對黃瓜靶斑病菌皿內生長的抑制效果,以期為開發防治黃瓜靶斑病的新藥劑和科學合理使用殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

由西北農林科技大學植物保護學院蔬菜病害及生物防治實驗室于陜西延安地區大田內病害重發區采樣分離獲得,編號20190601。經純化后, 4 ℃保存于PDA培養基斜面上,備用。

1.2 供試藥劑

供試藥劑的名稱、有效成分含量、毒性及生產廠家見表1。

表1 供試藥劑Table 1 Fungicides for test

1.3 培養基

PDA培養基(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂糖15～20 g),121 ℃滅菌30 min,供菌株活化培養與后續試驗使用。含藥培養基(原藥的含藥培養基制備需使用有機溶劑,將原藥用丙酮溶解,0.01 g原粉中加入1 mL丙酮制成濃度為10 mg/mL的母液,備用)。

1.4 病原菌形態學鑒定

從接種后發病的植株葉片上分離病原菌,分離物于PDA平板上培養,28 ℃恒溫培養7 d,為確定分離獲得的病原為多主棒孢霉,觀察培養基生長的菌落形態、培養形狀,并利用顯微鏡觀察其分生孢子、分生孢子梗、菌絲體等形態特征。

1.5 病原菌分子生物學鑒定

利用真菌rDNA-ITS特異性引物對分離菌株核糖體內轉錄間隔區進行擴增。

上游引物:ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′; 下游引物:ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

首先利用真菌基因組提取試劑盒提取黃瓜靶斑病菌基因組。其次進行rDNA-ITS序列的PCR擴增,擴增體系:2×Reaction Mix 9.5 μL,ddH2O 12.5 μL,正反向引物各1 μL,模板DNA 1 μL;擴增條件:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性 30 s,58.5 ℃退火90 s,72 ℃延伸30 s,35個循環,72 ℃ 10 min。第三步進行PCR產物電泳檢測。第四為擴增片段送測序。第五步作序列比對:將測序結果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)中進行Blastn比對。第六步利用MEGA X 10.1.8,基于rDNA-ITS序列構建NJ(Neighbor-Joining,鄰接法)系統發育樹,Bootstrap值為1 000。

1.6 殺菌劑對黃瓜靶斑病菌的毒力測定

1.6.1 菌株的活化 將供試菌株轉接到PDA培養平板上于28 ℃無光照條件下進行活化培養,7～8 d后待菌絲長滿整個培養基時用于后續 試驗。

1.6.2 不同濃度藥劑PDA平板制備 根據前期預備試驗所得結果,將原藥母液及各種單劑、復配劑稀釋成適宜的5個梯度濃度的藥劑稀釋液。吸取1 mL藥液并加入9 mL融化后冷卻至50～60 ℃的PDA培養基在培養皿內搖勻,使之凝固。由此得到包含5個梯度濃度的含藥培養基。以無菌水作空白對照,每個處理設置3次重復。

1.6.3 不同藥劑抑菌效果測定 菌株實現活化后,取0.5 cm菌餅轉接到上述的含梯度濃度藥劑和空白對照的PDA培養平板中。28 ℃倒置培養7～8 d。待對照中菌落覆蓋整個平板時,采用十字交叉法測量各處理菌落直徑。

整理數據并計算各處理所測菌落直徑均值。根據(1)式得到各菌落凈增長直徑,根據(2)式計算各處理相對應的抑制率。以藥劑濃度的對數值為橫坐標,抑制率為縱坐標,使用DPS 7.05 軟件處理系統計算11種殺菌劑對黃瓜靶斑病菌毒力回歸方程、相關系數、EC50及其95%置信限。

菌落直徑(d) = 測量菌落直徑平均值-0.5

(1)

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

(2)

1.7 孢子懸浮液制備

將已完成活化培養的菌株加入無菌水,用接種環在培養基表面輕輕摩擦,使分生孢子懸浮于蒸餾水中。然后3層紗布過濾除去菌絲。孢子濃度調至低倍鏡下每個視野約20個分生孢子。

1.8 不同藥劑對分生孢子萌發的影響

根據皿內抑菌試驗,選擇最優的藥劑用無菌水稀釋成0.12、0.24、0.48、0.96、1.92 mg/L,并設置空白對照。處理藥劑與孢子懸液按1∶1的體積比混合。用滴管吸取融化后的WA培養基于載玻片上,待凝固后,用移液槍吸取20 μL各處理藥劑滴于載玻片上,置于保濕培養箱中,黑暗條件下培養一段時間進行后續觀察。當對照組孢子萌發率達到90%以上時,統計各處理孢子萌發情況。以孢子芽管長度大于孢子長度一半時視為萌發。每個處理3次重復。調查各處理孢子總數不少于100個。記錄孢子萌發數及孢子總數,計算藥劑對孢子萌發的抑制率。

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

(3)

2 結果與分析

2.1 形態特征鑒定

顯微鏡觀察見圖1所示,分生孢子多單生于分生孢子梗上,呈倒棍棒形或圓柱形,淺褐色至褐色,直立或略彎曲,不分支,分隔1至多個,長度約為30～300 μm,寬度約為10 μm。菌絲無色,具分支與隔膜。分生孢子梗直立或略微彎曲,不分支,具隔膜,有時基部呈現膨大狀。

菌落形態見圖2,28 ℃下在PDA培養基中暗培養7 d菌落直徑可達75 mm。生長均勻,菌落呈輻射狀展開,生長致密,向上隆起;隨著培養時間的增加,菌落顏色逐漸變深,一般中央呈黃褐色,邊緣呈白色;菌落圓形,邊緣整齊;無色素 泌出。

通過對靶斑病菌菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態的觀察以及菌落在PDA培養基上的培養特性的描述,經鑒定與文獻中報道的關于黃瓜靶斑病菌的描述一致,確定引起陜西地區黃瓜靶斑病的病原菌為多主棒孢霉(C.cassiicola)。

2.2 分子生物學鑒定

分離純化后的菌株20190601經rDNA-ITS序列PCR擴增后,得到大小在500～750 bp的片段(圖3)。將擴增產物測序后獲得大小為564 bp的片段,經BLAST進行同源序列比較,結果表明分離菌株與多個Corynesporacassiicola菌株相似性大于99%。基于rDNA-ITS區構建系統發育樹(圖4)。在bootstrap重復1 000次的基礎上,菌株20190601與C.cassiicola(MG976657.1,JN034677.1)以99%自舉值聚在同一分支,進化距離最接近,基于此確定分離菌株為多主棒孢霉(C.cassiicola)。

圖3 菌株20190601 rDNA-ITS序列PCR鑒定Fig.3 PCR identification of rDNA-ITS of strain 20190601

圖4 基于鄰接法構建菌株20190601與21種相關菌株的ITS序列系統發育樹Fig.4 Construction of phylogenetic tree for rDNA-ITS of strain 20190601 and other 21 related strains based on neighbor-joining method

2.3 不同殺菌劑對黃瓜靶斑病菌室內毒力測定

在第8天對照組靶斑病長滿整個培養基時,統計數據。由表2可知,各藥劑之間對黃瓜靶斑病菌菌絲生長的抑制效果差異明顯。甾醇抑制劑類殺菌劑(咪鮮胺)對菌絲生長抑制作用最為顯著,EC50為0.124 6 mg/L;三唑類殺菌劑(苯醚甲環唑和氟硅唑)以及兩種復配劑(苯甲·吡唑酯和氟酰羥·苯甲唑)對靶斑病菌絲生長有較強的抑制作用,EC50介于1.793 6到3.343 8 mg/L;苯甲·嘧菌酯與戊唑醇對靶斑病菌皿內抑制效果良好,EC50介于20.572 2到25.960 1 mg/L;抗生素類(多抗霉素)、甲氧基丙烯酸酯類(吡唑醚菌酯)殺菌劑皿內抑制作用效果不顯著,EC50介于183.980 5到241.261 8 mg/L;而露娜森(氟菌·肟菌酯)對黃瓜靶斑病菌的皿內抑制效果較差。

表2 10種殺菌劑對黃瓜靶斑病菌毒力Table 2 Toxicity test of 10 fungicides against C.cassiicola

2.4 咪鮮胺對黃瓜靶斑病菌孢子萌發的影響

第2天對照組孢子萌發率達到90%以上時,統計各組孢子萌發率。由表3可知,咪鮮胺對黃瓜靶斑病菌孢子萌發的抑制作用隨著藥劑濃度的增大而加強。根據上述(3)式計算各處理組相對應的抑制孢子萌發率。以藥劑濃度對數值為橫坐標,抑制孢子萌發率為縱坐標,使用DPS 7.05 軟件處理系統求得毒力作用結果。分析結果可知,咪鮮胺對黃瓜靶斑病菌菌絲生長與孢子萌發均具有較強的抑制作用(表4)。另外,咪鮮胺對孢子形態結構的影響表現在孢子萌發過程中芽管局部發生膨大(圖5)。

圖5 0.96 mg/L咪鮮胺處理20 h后黃瓜靶斑病菌分生孢子形態Fig.5 Abnormality of conidiospore of C.cassiicola treated with 0.96 mg/L of Prochloraz for 20 h

表3 96%咪鮮胺對黃瓜靶斑病菌孢子萌發的抑制作用Table 3 Effect of prochloraz 96% on C.cassiicola conidial germination

表4 96%咪鮮胺對黃瓜靶斑病菌孢子萌發毒力Table 4 Toxicity test of prochloraz 96% to conidial germination of C.cassiicola

3 結論與討論

目前,已正式登記用于防治黃瓜靶斑病的藥劑多以苯甲·咪鮮胺、咪鮮胺和露娜森等[7],在黃瓜產區具有良好的防治效果。本研究通過對黃瓜靶斑病菌進行室內毒力測定,篩選7種對黃瓜靶斑病菌有較高毒力的殺菌劑。其中咪鮮胺對黃瓜靶斑病菌的毒力測定結果與遲曉紅等[6]及徐麗慧等[8]報道較為一致;苯醚甲環唑和戊唑醇對黃瓜靶斑病菌的毒力測定結果與徐麗慧等[8]、張乃樓等[9]測定結果相差無幾,但本試驗所測戊唑醇EC50值相對較高,可能與菌株地理來源不同有關;張乃樓等[9]報道遼寧省各供試菌株對單一藥劑(戊唑醇或苯醚甲環唑)敏感性表現整體一致,無顯著差異,但存在敏感性降低的菌株。也有學者報道黃瓜靶斑病菌株對藥劑的敏感程度與其地理來源并不明顯相關,但對同一省內不同地區而言,病原菌對藥劑毒力的抗性反應可指導其黃瓜生產過程中的合理用藥。劉衛民等[10]報道 42.8%氟菌·肟菌酯SC對黃瓜靶斑病的防治效果,施藥一周后防效可達81.3%。本研究經多次試驗,發現43%氟菌·肟菌酯SC對黃瓜靶斑病菌皿內生長抑制效果不明顯,可能已產生抗藥性。