非生物脅迫下青花菜LncRNA內參基因的篩選

裴徐梨 焦鵬 荊贊革 杞如春 王定康 唐征

摘 要 長鏈非編碼RNA在植物抵御逆境脅迫中起著重要作用。適宜的內參基因是準確評價其表達水平的基礎。本研究利用實時熒光定量PCR技術檢測16個青花菜LncRNAs表達水平，并通過geNorm、NormFinder、BestKeerper軟件進行表達穩定性分析。結果表明：青花菜的16個LncRNAs在不同逆境脅迫下表達穩定性存在差異。其中在弱光脅迫條件下，? XLOC_000400表達最穩定；在低溫脅迫條件下? XLOC_030832基因穩定性最好；在干旱和漬水脅迫條件下最穩定表達的內參基因分別是? XLOC_007087和? XLOC_012179；高溫和鹽脅迫處理下最穩定表達的內參基因均為? XLOC_007980。? XLOC_010342和? XLOC_007980在青花菜不同逆境脅迫下的表達穩定性較好。研究結果可為準確定量青花菜不同逆境脅迫下的LncRNAs提供合適的內參基因。

關鍵詞 青花菜；內參基因；長鏈非編碼RNA；非生物脅迫

長鏈非編碼RNA（Long Non-coding RNA，LncRNA）是一類長度大于200 bp的內源RNA，可參與植物成花轉變、花粉發育、逆境脅迫響應等多種生物學過程。扎桑等[1]在對2個青稞品種進行鹽堿脅迫過程中獲得了6 704條LncRNAs，同時發現不同階段的鹽堿脅迫中有不同的lncRNAs參與脅迫應答；許欣[2]在鹽脅迫剛毛檉柳LncRNA轉錄組測序分析后，發現在脅迫過程中lncRNA對差異表達基因的調控起重要作用；分析黃瓜響應高溫脅迫時發現一些lncRNAs可通過調控基因表達來響應脅迫[3]；除此之外，在新疆楊中鑒定了10 531個lncRNA，發現在鹽脅迫下有60%的lncRNA參與了脅迫應答的過程[4]。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）是基因表達分析研究中應用最為廣泛的方法之一。然而qRT-PCR的使用還存在一些問題，如在基因表達相對定量時，需要有適宜的內參基因作為標準來衡量目標基因的表達水平，從而確保試驗結果準確。

內參基因表達的穩定性在不同品種、不同逆境脅迫或是不同組織器官中表達的穩定性不盡相同。再加上同mRNA相比較，LncRNAs表達量更低，因此選擇編碼蛋白的基因作為內參來研究LncRNA的表達量，就不一定能很準確地反映其表達水平的高低。試驗前期課題組對青花菜高溫和鹽脅迫LncRNAs進行了高通量測序，基于FPKM法計算的表達水平，從中篩選出多個表達較穩定的LncRNAs作為候選內參基因，利用實時熒光定量PCR技術并運用geNorm、Normfinder和BestKeeper軟件對青花菜不同非生物脅迫下的表達穩定性進行分析。通過綜合分析得到適宜的內參基因，研究結果可為青花菜不同非生物脅迫下LncRNAs的表達計算提供適宜的內參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和脅迫處理

以青花菜自交系“KU19-3”為材料，放置于光照培養箱內進行培養。晝夜溫度為25 ℃/18 ℃，光照周期為16 h/8 h。五葉期時進行非生物脅迫處理。脅迫處理如下：高溫（40 ℃）、低溫（4 ℃）、干旱（PEG 10%）、漬水（淹水高于基質表面）、弱光（30％光照度）、鹽脅迫（100 mmol/L NaCl灌根），分別在處理后0、3、12和24 h取樣。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

提取的葉片總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，而后采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TaKaRa公司）反轉錄成cDNA第一鏈。

1.3 引物設計

根據筆者課題組高溫和鹽脅迫LncRNA的測序結果（相關結果已發表在西北農業學報）篩選出16個表達較穩定的LncRNA，設計熒光定量引物（表1）。

1.4 熒光定量PCR和表達穩定性分析

qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司）在ABI 7500（Applied Biosystems公司）上運行。反應體系和參數參照裴徐梨[5]的方法。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對候選LncRNA的表達穩定性進行分析。

2 結果與分析

2.1 LncRNA候選內參基因擴增特異性分析

對候選LncRNA內參基因進行熔解曲線分析，結果顯示為單一峰（圖1）。表明設計的引物擴增特異性好。

2.2 LncRNA候選內參基因穩定性評價

2.2.1 geNorm穩定性評價 從圖2可以看出，高溫脅迫下，? XLOC_000400和? XLOC_008536的M 值最小，表達穩定性最好；低溫脅迫下，? XLOC_007980和? XLOC_008536表達穩定性最好；在鹽脅迫下，? XLOC_000108和? XLOC_000400表達穩定性最好；在漬水脅迫下，? XLOC_007087和? XLOC_012179表達穩定性最好；干旱和弱光脅迫下均是? XLOC_007980和? XLOC_034687表達穩定性最好。而? XLOC_034059的M值在6種非生物脅迫中均較大，表現最不穩定。

2.2.2 NormFinder穩定性評價 由NormFinder軟件評價結果可知，高溫脅迫下? XLOC_007980和? XLOC_012179穩定值均為0.064，穩定性最好；低溫脅迫下? XLOC_010342和? XLOC_025578穩定值（0.038）最??；干旱脅迫下? XLOC_021473和? XLOC_029328穩定值均為0.013，穩定性最好；漬水脅迫下? XLOC_012179和? XLOC_021473的表達最穩定，穩定值均為0.060；在弱光和鹽脅迫下，表達最穩定的是? XLOC_000400，穩定值分別為0.047和0.049。? XLOC_034059的穩定值在6種脅迫下均最高，穩定性差（表2）。

2.2.3 BestKeeper穩定性評價 BestKeeper軟件評價結果表明，高溫脅迫下表達最穩定的是? XLOC_037050，其SD值為0.15；低溫脅迫下? XLOC_012179 SD值為0.23，表達最穩定。? XLOC_034059在這兩種脅迫下SD值最大，穩定性最差。漬水和鹽脅迫下表達最穩定的分別是? XLOC_012179（SD=0.46）和? XLOC_007980?（SD=0.16），最不穩定的均為? XLOC_039609；弱光脅迫下? XLOC_010342表達最穩定，SD值為0.13，? XLOC_007980（SD=0.68）表達最不穩定；干旱脅迫下? XLOC_015579（SD=0.15）表達最穩定，? XLOC_030832表達最不穩定，SD值高達1（表3）。

2.2.4 LncRNA候選內參基因穩定性綜合評價 通過geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件獲得的最適內參基因有所差異，因此將數據進行綜合分析。結果顯示，在弱光脅迫條件下，最穩定的內參基因為? XLOC_000400；在低溫脅迫條件下? XLOC_030832基因穩定性最好；在干旱脅迫和漬水脅迫條件下最穩定表達的內參基因分別是? XLOC_007087和? XLOC_012179；高溫和鹽脅迫處理下最穩定表達的內參基因均為? XLOC_007980。綜上所述，? XLOC_010342和? XLOC_007980為青花菜不同逆境脅迫下的LncRNAs準確定量的最適宜內參基因（表4）。

3 討? 論

植物內參基因通用性不是特別高。同一內參基因在不同的生長階段、不同組織細胞、不同環境以及不同脅迫下，其穩定性也會有所不同。如內參基因 UBC18、 ACT2-1和 EF1a在毛竹實生苗中表達性較好，但在開花竹中穩定性較差[6]。在非生物脅迫下的番茄植株根和葉中，Actin表達穩定，莖中SAND基因表達穩定[7]。本研究對青花菜中多個LncRNA在非生物脅迫下的表達穩定性進行分析，結果發現? XLOC_000400弱光脅迫下表達穩定，而在漬水脅迫下其穩定性卻較差；? XLOC_007980也存在類似的現象，其在鹽脅迫下表達穩定，而在漬水脅迫下表達最不穩定。試驗結果表明，在篩選青花菜LncRNA內參基因時，其穩定性也表現出此現象。

內參基因在不同的試驗條件或不同逆境處理下的表達是不恒定的[8]。在本試驗中發現geNorm、NormFinder和BestKeeper的分析結果有較大差異，但也有共同點：? XLOC_034059在所有環境脅迫中都表現極不穩定，? XLOC_000108和? XLOC_039609在高溫、干旱和鹽脅迫下表現極不穩定。這些研究結果表明候選的青花菜LncRNAs在不同試驗條件下的表達穩定性存在差異，所以針對不同非生物脅迫處理需選擇適宜的內參基因。

參考文獻 Reference：

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Abstract Long non-coding RNAs（LncRNAs） plays important role in plant resistance to stress.Appropriate reference genes are the basis to accurately evaluate their expression levels.In this study， real-time fluorescent quantitative PCR technology was used to detect the expression levels of 16 LncRNAs in broccoli， and their expression stability was analyzed by geNorm， NormFinder， and BestKeerper software.The results showed that 16 LncRNAs revealed diverse expression stability under different stresses in broccoli.Among them，? ?XLOC_000400 was the most stable under low light stress;? ?XLOC_030832 had the best stability under low temperature stress; the most stable reference genes under drought and waterlogging stress were? ?XLOC_007087 and? ?XLOC_012179， respectively; under high temperature and salt stress， the most stably reference gene was? ?XLOC_007980.In conclusion，? ?XLOC_010342 and? ?XLOC_007980 have good expression stability under different stresses in broccoli.This study provides suitable reference genes for further research on the expression of LncRNAs under abiotic stresses in broccoli.

Key words Broccoli; Reference gene; Long non-coding RNA; Abiotic stress