灰蘚科4種蘚類植物孢子萌發與原絲體發育特征

黃士良 賈素巧 王曉蕊 李琳

摘 要 通過室內人工培養的方式，在微米量級下觀察灰蘚科灰蘚屬（Hypnum）灰蘚（H.cupressiforme）、黃灰蘚（H.pallescens）、多蒴灰蘚（H.fertile），金灰蘚屬（Pylaisia）金灰蘚（P.polyantha） 4種蘚類植物孢子萌發和原絲體發育過程，詳細記錄其發育過程的性狀特征。結果顯示：（1）4種蘚類植物的孢子均為單細胞，直徑平均值為10～40? μm。（2）黃灰蘚孢子為壁內萌發，灰蘚、多蒴灰蘚、金灰蘚孢子為壁外萌發。4種蘚類植物發育初期均未出現初生假根，有次生假根出現。4種蘚類植物在發育中出現了塊狀原絲體和絲狀原絲體兩種形態，其原絲體在發育初期均沒有產生初生軸絲體，均是在原絲體發育后期，軸絲體由綠絲體分化產生。（3）參照Nishida對蘚類植物孢子萌發和原絲體發育類型劃分標準，對灰蘚科4種蘚類植物的原絲體發育特征進行歸類分析，灰蘚屬黃灰蘚原絲體發育類型為高領蘚型（Glyphmitrium-type）；灰蘚屬灰蘚、多蒴灰蘚，金灰蘚屬金灰蘚3種蘚類植物原絲體發育類型均為真蘚型（Bryum-type）。

關鍵詞 灰蘚科；孢子萌發；原絲體發育；孢子萌發型

蘚類植物孢子萌發、原絲體發育和配子體發生階段是其生活史中一段復雜的過程，其間呈現出的性狀特征成為種屬間形態分類的有力依據[1]。隨著研究的不斷深入，越來越多的蘚類植物原絲體發育階段被人們所熟悉，其發育過程性狀特點也成為蘚類植物分類學上的有益補充。Nishida[2]是對蘚類植物原絲體發育和孢子萌發型系統性研究比較早的國外專家。2009年，Pressel等[3]對不同種類苔蘚植物原絲體各個階段發育的特點進行了一系列的試驗觀察。2020年，Sangeeta等[4]研究了植物激素在苔蘚原絲體分化中的相互作用，認為生長素、乙烯和環腺苷酸通過提高細胞內鈣濃度而促進原絲體的分化。Johri[5]研究了生長素在苔蘚原絲體分化中的作用，認為在固定懸浮培養中，原絲體細胞分化狀態受孢子接種密度和生長素水平的調控。2016年，Natalia等[6]研究了藥用苔蘚原絲體懸浮培養體系的建立，并對培養基、營養條件、初始pH、接種量等提高生物量的關鍵因素進行評價。國內最早對苔蘚植物原絲體發育進行系統研究的學者是高謙等，1986年，高謙等[7]研究蘚類植物孢子萌發和原絲體發育對苔蘚植物的各分類群之間的關系和種系發生及系統演化，此后，關于蘚類植物原絲體發育的研究較少，直到21世紀初，相關報道逐漸增多。自2002年以來，趙建成等[8]及黃士良等[9-11]系統研究了百余種側蒴蘚類和頂蒴蘚類植物孢子萌發和原絲體發育特征，他們的研究為中國蘚類植物發育學研究提供了重要的基礎資料。

灰蘚科（Hypnaceae）是側蒴蘚類植物中最具多樣化的一個類群，是蘚類植物中較大的科，分布世界各地，該科多數種類屬于旱生性蘚類植物，科內屬間和種間差異甚微，灰蘚科是蘚類植物學家公認的分類難度較大的科 ，在灰蘚屬中表現尤為突出[12]。由于灰蘚科灰蘚屬和金灰蘚屬中蘚類植物生態幅度寬廣，生境存在多樣性，種類存在多形，常產生變異類型的種，單憑配子體的形態顯微結構較難區分，因此，通過研究兩屬蘚類植物孢子萌發、原絲體發育及配子體發生特征，從發育學角度對灰蘚科植物分類提供直接或間接的佐證依據。同時，灰蘚屬部分蘚類植物具有藥用價值，通過對該屬蘚類植物配子體發育進行基礎性研究，以期為深入開展苔蘚的人工栽培、開發和利用提供基礎數據。

目前，中國灰蘚科的相關研究多從灰蘚科分類與區系的角度開展，關于灰蘚科植物原絲體發育的系統性研究未見報道。本研究選擇中國產灰蘚科具有孢子體的2屬4種蘚類植物，詳細觀察了其孢子萌發、原絲體發育、配子體分化的過程，并系統分析了該科4種蘚類植物發育特征，旨在探索灰蘚科植物系統分類、生態學與發育學的相關性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自灰蘚科4種蘚類植物標本成熟孢蒴內的孢子。

灰蘚Hypnum cupressiforme，李琳 N0064（HBNU），2016年8月11日，河北省平山縣駝梁山（38°43′14.64″N， 113°48′54.18″E），海拔1 200 m，土生。

黃灰蘚Hypnum pallescens，黃士良 N0045（HBNU），2018年8月10日，河北隆化縣茅荊壩林場（41°31′34.09″ N， 118°07′8.25″E），海拔1 100 m，腐木生。

多蒴灰蘚Hypnum fertile，黃士良 N0036（HBNU），2016年8月11日，河北省平山縣駝梁山（38°43′0.11″ N， 113°48′56.50″E），海拔1 100 m，腐木生。

金灰蘚Pylaisia polyantha，黃士良 N0029（HBNU），2019年8月6日，河北省鹿泉市封龍山（37°54′6.30″N， 114°18′53.15″E），海拔400? m，巖面薄土。憑證標本存放于河北師范大學植物標本館（HBNU）[12]。

1.2 試驗方法

參照文獻［9］和［11］的試驗方法進行。

1.3 試驗步驟

培養基的制備：在一定量的改良Knop營養液中加入2%瓊脂，加熱熔化后，倒入60 mm的培養皿中，凝固后即可使用[9]。

孢子懸液的制備：把孢蒴浸入75%的酒精溶液中，20 s后取出，并在無菌蒸餾水中清洗5次；然后，用鑷子和解剖針將孢子取出并散入無菌蒸餾水中，制成適當濃度的孢子懸液[9，11]。

孢子懸液轉移：用移液器將稀釋的孢子懸液接種于培養基上。

相關參數：培養皿加蓋后放在光照培養箱（產品型號為KRG-250A）中培養。溫度23 ℃±2 ℃，相對濕度大于80%，光照強度24? ?μmol/（m2·s），光照時間12? h/d。

鏡檢要求：自接種培養之日起，每隔24 h鏡檢孢子發育情況，每次鏡檢標本量為15～20個孢子的發育情況，詳細記錄個體的發育狀況，并進行顯微照相及繪圖。

2 結果與分析

通過顯微鏡下觀察灰蘚科4種蘚類植物孢子萌發與原絲體發育過程，記錄每種孢子萌發特點及原絲體發育過程的性狀特征（圖1），對發育特征進行歸類統計（表1）。

2.1 孢子特征

4種蘚類植物的孢子均為單細胞，體積較小，大小不均勻，直徑平均值為10～40? μm。根據表1的孢子特征歸類可以看出，孢子形狀均為球形或近球形，近極面觀多為圓形或近圓形（圖1-1、1-2、1-3、1-4）。孢子表面紋飾大體相近，一般為細疣狀或瘤狀。

2.2 孢子萌發與原絲體發育特征

2.2.1 孢子萌發特征 由圖1和表1可知，4種蘚類植物中黃灰蘚為壁內萌發（圖1-6），灰蘚、多蒴灰蘚、金灰蘚為壁外萌發（圖1-5、1-7、1-8）。灰蘚與金灰蘚為多極萌發，多蒴灰蘚與黃灰蘚為1～3極萌發。

2.2.2 初生假根與次生假根 4種灰蘚科蘚類植物在培養期內均未出現初生假根，其中黃灰蘚和灰蘚均在原絲體發育中期由綠絲體分化形成次生假根。4種蘚類植物在配子體發育形成后，在配子體基部產生假根。

2.2.3 原絲體與軸絲體的分化 4種蘚類植物在發育中出現了塊狀原絲體和絲狀原絲體兩種形態。黃灰蘚孢子為單細胞孢子，屬于內生孢子萌發類型，在培養36 h后開始壁內萌發，產生2個相等細胞的塊狀原絲體；隨后，其中一個細胞的原生質膜突破外壁開始凸出孢外，形成綠絲體原始細胞，并不斷伸長；綠絲體原始細胞在伸長的同時，產生的2個相等細胞繼續分裂，形成由4～6個細胞組成的塊狀原絲體（圖1-6）。塊狀原絲體的每個細胞都開始分化產生綠絲體原始細胞，測量塊狀原絲體的直徑約為53? ?μm。7? d時，60％的塊狀原絲體出現1～3極萌發現象（圖1-10），20％的塊狀原絲體上產生的綠絲體已經分化產生1～4個細胞，綠絲體長達到170? ?μm，綠絲體細胞長50? ?μm，直徑12? ?μm。第20天時，原絲體的密度逐漸增大，軸絲體大量產生，交互生長，特別是在綠絲體基部，密度最大（圖1-13）。在綠絲體頂端細胞或側枝開始分化出次生假根。

灰蘚、多蒴灰蘚和金灰蘚3種蘚類植物屬于外生孢子萌發類型，在發育過程中僅出現絲狀原絲體（圖1-7，1-8）。其中多蒴灰蘚和金灰蘚孢子均在培養60 h后，開始壁外萌發。多蒴灰蘚在培養7 d后，80%的孢子已經萌發，萌發極向為1～4極萌發；14 d后，多蒴灰蘚以綠絲體基部細胞為中心出現大量綠絲體分枝（圖1-11）；19 d后，在綠絲體頂端分化出現氣生綠絲體，伸向基質外部空間生長。在培養5 d后，金灰蘚孢子開始出現3極萌發現象，絲狀綠絲體產生側枝，側枝和綠絲體接近垂直生長（圖1-14）；在綠絲體二級側枝形成后，部分深入到基質中分化形成假根。灰蘚在培養90 h后孢子開始壁外萌發；第7天時，95%以上的孢子已經萌發，萌發極向為1～4極；第15天時，綠絲體產生大量二級側枝，分化出現次生假根（圖1-9、1-12）。

4種蘚類植物原絲體在發育初期均沒有產生初生軸絲體，均是在原絲體發育后期，軸絲體由綠絲體上分化產生。黃灰蘚在培養至第17天時，綠絲體頂端細胞開始分化產生軸絲體細胞。金灰蘚在培養至第23天時，綠絲體頂端細胞開始分化產生斜壁細胞，分化成軸絲體。灰蘚在培養至第26天時，綠絲體前端開始分化產生軸絲體。多蒴灰蘚在培養至第30天時，綠絲體頂端細胞開始分化產生軸絲體細胞。

2.2.4 配子體發生方式 4種蘚類植物的配子體發生存在2種方式：第1種是配子體原始細胞在綠絲體基部細胞上分化產生，如金灰蘚培養至第35天時、灰蘚培養至第26天時和多蒴灰蘚培養至第45天時，3種蘚類植物均在綠絲體基部細胞上分化產生芽體，即配子體原始細胞（圖1-16、1-18、1-19）；第2種是配子體原始細胞在綠絲體和軸絲體上同時產生，如黃灰蘚培養至第24天時，在綠絲體和軸絲體上開始分化產生配子體原始細胞（圖1-17）。金灰蘚培養至第40天、灰蘚培養至第32天、多蒴灰蘚培養至第50天和黃灰蘚培養至第31天時記錄觀察，4種蘚類植物配子體均已經出現4～10片幼葉（圖1-20、1-21、1-22、1-23）。

2.2.5 原絲體細胞異形和斷裂 金灰蘚在培養至第9天，部分綠絲體細胞內的葉綠體數量開始逐漸減少，同時葉綠體形狀出現萎縮，綠絲體細胞長度拉伸，形狀變成細長型；14 d后，金灰蘚綠絲體基部細胞體積逐漸變大，形狀呈近圓球形，隨后，綠絲體基部細胞之間的細胞壁逐漸消失；16 d后，金灰蘚原絲體細胞發生縊裂，形成細胞數目不等的多個斷裂原絲體段，各自獨立生長（圖1-15）。黃灰蘚、多蒴灰蘚和灰蘚3種蘚類植物原絲體在發育過程中均未發現有原絲體細胞斷裂現象。

金灰蘚、多蒴灰蘚和灰蘚3種蘚類植物原絲體細胞均為絲狀長圓柱形細胞（圖1-11、1-12、1-14），而黃灰蘚在培養至第18天時，綠絲體的分枝繼續增多，從綠絲體基部細胞到頂端細胞上的分枝數逐漸減少，原絲體細胞多數發育成橢圓形細胞，整個原絲體系統呈現一個不規則圓形，原絲體由中間向四周散射生長（圖1-17）。

2.3 孢子萌發型

根據灰蘚科4種蘚類植物孢子萌發、原絲體發育和配子體細胞分化特點，將孢子萌發型劃分成真蘚型和高領蘚型2種類型。其中灰蘚屬灰蘚、多蒴灰蘚和金灰蘚屬金灰蘚3種蘚類植物孢子萌發型為真蘚型。真蘚型發育主要特征為絲狀原絲體由長圓柱形細胞組成，原絲體系統包含綠絲體和軸絲體，配子體的原始細胞由綠絲體分枝的基部細胞產生。灰蘚屬黃灰蘚孢子萌發型為高領蘚型。高領蘚型發育主要特征為原絲體系統缺乏軸絲體，塊狀原絲體的所有細胞在伸長的壁內形成，假根由塊狀原絲體或配子體基部發育而來。

3 結論與討論

3.1 孢子萌發型與灰蘚科植物系統發育

由于植物發育過程所表現出的性狀特征具有穩定性，因此，蘚類植物原絲體發育過程所表現出來的特征、規律也與其分類關系具有密切的相關性[1]。灰蘚科被認為是蘚類植物分類難度較大的科，將原絲體發育性狀作為該科植物分類的依據，具有重要的意義。王利松等[12]遵循Frey和Stech的系統，將金灰蘚屬從灰蘚科移除，置于金灰蘚科（Pylasiaceae）中。本研究中，金灰蘚［Pylaisia polyantha （Hedw.） Bruth & Schimp.，賈渝等，2013，2018］孢子萌發方式、假根的產生、原絲體形態、綠絲體與軸絲體的分化、配子體發生方式及原絲體細胞形態等特征均與灰蘚、多蒴灰蘚具有共性，只有原絲體細胞在發育過程中發生縊裂這一特征與灰蘚屬3種植物產生差異，關于金灰蘚在2倍孢子體發育階段，是否存在更多差異性，還需要進一步探索。

4種蘚類植物僅存在真蘚型和高領蘚型2種孢子萌發型，其中以真蘚型為主。日本學者Nishida[2]研究過的南亞灰蘚（Hypnum oldhamii）和大灰蘚（Hypnum plumaeforme）孢子萌發型均為真蘚型，2種蘚類植物孢子均為壁外萌發，產生絲狀原絲體，配子體原始細胞在綠絲體或軸絲體上分化產生，2種蘚類植物原絲體發育過程特征和本研究中的4種蘚類植物發育過程特征具有共性，不同之處在于原絲體發育過程沒有出現縊裂現象，這一點和金灰蘚原絲體發育中的縊裂現象依然有區別。灰蘚屬中孢子萌發類型以真蘚型為主，這為本屬蘚類植物原絲體發育特征具有較為進化的特性提供了有力依據[2，9-11]。

在原絲體的性狀演化順序上，塊狀原絲體與絲狀原絲體相比，塊狀原絲體特征是相對低等的，絲狀原絲體是原絲體發育形態中的較為進化的性狀特征[1-2]。在本研究的4種灰蘚科蘚類植物中，黃灰蘚原絲體發育過程中出現相對低等的塊狀原絲體特征。4種灰蘚科植物在原絲體發育過程中都是以絲狀原絲體為主體，說明絲狀原絲體為其單倍體發育階段的重要特征[13]。

3.2 孢子萌發型與灰蘚科植物的生態適應

蘚類植物孢子萌發型與其生存環境存在密切相關性，如泥炭蘚型的片狀原絲體是對多水環境的適應，而黑蘚類的塊狀原絲體是與極干旱環境相適應。塊狀原絲體是在孢壁內萌發形成，原絲體與外界接觸面積減少，也就相應減少了植物體內水分的蒸發和流失，因此，干旱少雨的極端環境促使部分蘚類植物在孢子萌發和原絲體發育階段出現塊狀原絲體性狀[2，11]。

本研究中灰蘚科2個屬的蘚類植物多生于腐木、樹干、土層、林下巖面等，具有多種多樣的生境特征，發育過程只存在真蘚型和高領蘚型兩種萌發類型。萌發型為高領蘚型的黃灰蘚發育過程中出現塊狀原絲體，但塊狀原絲體狀態僅存在于孢子萌發初期，存在時間較短，而絲狀原絲體存在狀態時間較長，說明其生存環境并不是極端干旱環境，這與采集時的環境特點相符。與塊狀原絲體相比，黃灰蘚的絲狀原絲體細胞多為短圓柱型和橢圓形細胞，這也進一步說明其生存環境相對比較干旱的特點。本研究中孢子萌發型以真蘚型的蘚類占多數，且發育過程中只出現絲狀原絲體，這種性狀與筆者早期所研究的真蘚科（Bryaceae）、叢蘚科（Pottiaceae）蘚類植物原絲體發育類型有著共性特點[7-8，11]，由此推斷，絲狀原絲體是生存發育共性選擇，是對環境適應較為進化的性狀特征。進化的標志特征是為適應大環境所產生的共性的適應性狀，孢子萌發型選擇真蘚型的蘚類植物，在發育過程中也恰恰呈現出這種共性特征[11]。

3.3 孢子萌發型與灰蘚科植物生殖策略

3.3.1 原絲體發育特征與生殖策略 從蘚類植物生境的多樣性可以看出生殖策略的多樣性，面對高大的被子植物，蘚類植物的生境選擇存在壓力，因此，身體矮小的蘚類植物為了擴大種群數量，保持生殖策略的多樣性，從而擁有更強大的適應性。

4種灰蘚科植物在試驗條件下，均完成從孢子萌發到原絲體發育，再到配子體產生的過程（圖1-20，1-21，1-22，1-23）。因實驗室培養條件優越，水分充足，很少蘚類植物在試驗條件下產生孢子體。說明在外界環境優越，尤其是水分充足的條件下，蘚類植物生殖策略選擇了r型生態對策，選擇通過無性生殖達到擴大種群目的，避免發生有性生殖帶來的生物能量過度消耗[1-2，10]。

金灰蘚原絲體細胞在發育中，部分發生細胞縊裂，產生獨立于原絲體系統的段狀原絲體，這些斷裂下來的原絲體依然保持生命力，繼續生長，在適宜的環境中可以繼續分化生長，發育成新的原絲體系統（圖1-15），這種細胞縊裂現象在劉保東等[14]研究過的波葉仙鶴蘚原絲體發育過程中也出現過，波葉仙鶴蘚軸絲體細胞在橫向壁連接處，發生膨脹，兩個細胞的接觸面積逐漸減小，最后形成“球面接觸”而易于斷裂（即本文中提到的原絲體細胞的縊裂），脫落后的軸絲體小段則很快逆轉為綠絲體繼續生長。因此，推測這種現象與原絲體無性繁殖相關，進一步說明金灰蘚和波葉仙鶴蘚在原絲體發育階段，只要生長發育環境條件優越，隨時可以采取選擇無性繁殖的生殖策略，達到快速擴大種群數量的目的。由此也可以看出，在蘚類植物生活史中，只要條件允許，可以隨時選擇無性繁殖的生物學特征[1，11]。原絲體的溢裂現象，也是植物體面對優越的生長條件，進行快速繁殖，達到擴大種群目的的無性繁殖策略。這種現象在叢蘚科蘚類植物發育過程中也出現過，且種類更多，說明植物面對極端干旱環境，調整生殖策略的靈活性[11]。在野外采集時，4種蘚類植物均生長有孢子體，采集生境為林下腐土、腐木或巖面，生境相對實驗室內環境干旱很多，因此，植物體面對相對干旱的環境，選擇了有性生殖策略，及時完成生活史，產生孢子體以度過惡劣環境。可以看出，對于同一種蘚類植物，孢子體產生的時間受制于生境水分的滿足度。

4種灰蘚科植物中，除了黃灰蘚配子體原始細胞分化產生的位置在綠絲體和軸絲體的產生（圖1-17），其他的3種蘚類植物均在綠絲體上產生（圖1-16，1-18，1-19），說明4種蘚類植物配子體產生方式的單一性。黃灰蘚產生塊狀原絲體是對干旱生境的適應，在生活史中的生殖階段，配子體原始細胞分化產生時間為24 d，為4種蘚類植物中時間最短的一個種類，其配子體原始細胞發生位置也采用了兩種方式，既在綠絲體上產生也在軸絲體上產生，這與該種蘚類植物面對干旱環境，采用豐富的生殖策略有著高度相關性。

3.3.2 雌雄同株與生殖策略 分析蘚類植物演化史，雌雄異株的蘚類植物和雌雄同株的蘚類植物生殖特征有較多差異性。但蘚類植物生殖條件中最重要的因素是水，生存在陰濕環境，形體比較矮小，伏地生長等特征都是適應借助水媒介完成有性生殖作用，這和其處在進化上的位置有重要的相關性[2，7，10]。如叢蘚科蘚類植物原絲體發育特征研究證實，對于生長在干旱環境中的蘚類植物，雌雄異株的數量明顯高于雌雄同株，這是蘚類植物進化中，生殖逐步擺脫水的制約，具備更高級性狀的表現[11，14-15]。本研究中4種灰蘚科植物均為雌雄同株[12]，其野外生境多為腐木生或土生，說明灰蘚科灰蘚屬和金灰蘚屬蘚類植物生殖策略選擇上存在差異，雌雄同株的蘚類植物對環境的適合度比雌雄異株的蘚類植物要低，生活史中對環境水分依賴度強，無性生殖階段時間長，無性繁殖對種群數量擴增貢獻度大[2-6]。要得出更科學的灰蘚科蘚類植物發育特征與該科進化的相關性，還需對該科不同種蘚類植物的發育特征進行細致入微的研究。

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Abstract In order to explore spore germination of? Hypnaceae? family， the spore germination and protonema development of four species in? Hypnaceae， H.cupressiforme， H.fertile， H.pallescens of genus Hypnum and P.polyantha of genus Pylaisia were observed and described at the micron level by means of indoor artificial cultivation. The results indicated that：（1） the spores of the four mosses were composed of single cells， with an average diameter of 10-40? μm; （2） the spores germinated on inside of the wall in H.pallescens and on outside of the wall in the other three species; （3） the four species had common features during their development，which inculded the appearance of no primary rhizoids ，but apearance of secondary rhizoids at the early stage.The appearance of the two forms of massive protonema and filiform protonema produced no primary axonema at the early stage and differentiated caulonema from chloronema at the late stage of protonema development; （4）? Nishidas? classification standard for moss spore germination， spore germination of the four hypnaceae species were analyzed and determined， the H.pallescens belonged to Glyphmitrium-type and H.cupressiforme， H.fertile and P.polyantha belonged to Bryum-type.

Key words Hypnaceae; Spore germination;Protonema development; Sporeling type