60Co-γ輻照藍莓鈣形態和亞細胞鈣分布對果實硬度的影響

王 琛 陶 燁 韓艷秋 張 銳 高 雅 李莉峰

（遼寧省農業科學院食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161）

藍莓（Vacciniumspp）是一種藍色或深紫色圓形漿果，采后極易軟化失水，遭受微生物的侵染，導致貨架期十分短暫［1-2］。硬度作為藍莓果實的重要感官品質，是決定其消費性、耐貯性和抗病性的關鍵因素［3-4］。研究表明，γ 輻照對藍莓果實硬度有積極影響，有利于藍莓的長期貯藏和長途運輸［5-7］。作者前期研究也發現，適當劑量的60Co-γ 輻照能夠啟動防御系統，抑制呼吸作用和活性氧代謝，有效地穩定細胞壁結構，延緩冷藏藍莓果實的軟化［8-10］。但有關60Co-γ 輻照對冷藏藍莓果實硬度的調控機理尚不清楚。賈展慧等［11］認為輻照在一定程度上會損傷果肉細胞膜系統，通過干擾基礎代謝過程促使細胞壁與膜系統的鈣含量增加，從而提高果實硬度。

鈣是植物細胞中的必需礦物質元素，在細胞膜和細胞壁的穩定、多種酶的調控、離子的滲透調節等方面具有重要作用［12］。鈣在植物體內有多種存在形態，主要包括游離態和結合態兩種。根據配體分子量大小，結合鈣又分為小分子配體結合鈣和大分子配體結合鈣［13］。細胞質內游離態鈣（Ca2+）濃度變化與Ca2+信號傳導有關［14］。小分子配體結合鈣包括草酸鈣、磷酸鈣、硅酸鈣以及多酚鈣等，主要分布在液泡、葉綠體、線粒體等細胞器中；大分子配體結合鈣包括果膠結合鈣和蛋白結合鈣等，主要分布在細胞壁上［15］。植物在生長發育和成熟老化過程中，不同形態的鈣會發生相互轉變，以完成復雜的生理活動［16］。

鑒于60Co-γ 輻照對冷藏藍莓果實硬度的積極影響，有必要進一步探明輻照藍莓果實鈣形態和鈣分布對果實硬度的影響。本研究采用0.5、1.5、2.5 kGy 輻照劑量處理藍豐藍莓，以未輻照為對照（CK），研究不同輻照劑量對果實硬度、果肉總Ca 含量、不同溶解性Ca含量和Ca在亞細胞分布的影響，以及上述指標與冷藏藍莓果實硬度的相關性，旨在為揭示輻照抑制冷藏藍莓果實軟化的作用機制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓品種為藍豐，采摘于沈陽時圣藍莓基地，果實成熟飽滿，大小色澤一致，且無病蟲害與機械損傷。采后藍莓分裝于帶氣孔的PET保鮮盒中（凈重125.0 g/盒），并于當日運回遼寧鈷源輻照中心。

硝酸、高氯酸、去離子水、氯化鈉、乙酸、鹽酸、蔗糖、氨基丁三醇、二硫赤蘚糖醇均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司（沈陽）。

1.2 主要儀器與設備

CT3-10K 型質構儀，美國Brookfield 公司；3200 型原子吸收分光光度計，安捷倫科技（中國）有限公司（北京）；HH-6數顯恒溫水浴鍋，常州國華儀器廠；PB-10型pH 計，北京賽多利斯儀器系統有限公司；ZK-82B 電熱真空干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 輻照處理 采用靜態輻照方式，源強為7.51×1015Bq。設定輻照劑量為0、0.5、1.5、2.5 kGy，輻照均勻度在1.03～1.07之間。輻照時間統一為72 min，輻照中途需360°翻轉。每組樣品重復輻照3次，然后置于（5±0.5） ℃冷庫貯藏。每隔5 d隨機抽取樣品，測定各指標。

1.3.2 測定指標與方法

1.3.2.1 果實硬度 每組樣品隨機挑選10 粒藍莓，在果實軸中心位置，用CT3-10K 型質構儀測定藍莓的果實硬度［8］。測試儀探頭直徑為2 mm，測試速度為1.0 mm·s-1，壓入深度為5.0 mm。記錄數據，取平均值。

1.3.2.2 果肉Ca 含量 參考Manganaris 等［17］的方法，分別稱取烘干的果肉50 mg，置于消煮管中，HNO3-HCIO4混合消化，用原子吸收分光光度計測定消化液的Ca含量。

1.3.2.3 Ca 的結合形態 參考劉劍鋒等［18］的方法，稱取藍莓果肉20 g，分別采用去離子水、1 mol·L-1氯化鈉、2%乙酸和5%鹽酸逐級依次提取水溶性Ca、NaCl溶性Ca、HAc 溶性Ca 和HCl 溶性Ca。所得各殘渣經65 ℃烘干后，于HNO3-HClO4混合消化，用原子吸收分光光度計測定消化液的Ca含量。

1.3.2.4 Ca 的亞細胞分布 參考朱國奇等［19］的方法，取10 g 冷凍藍莓果肉，加入5 倍的預先冷卻緩沖液（內含250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1二硫赤蘚糖醇，pH 值7.5）液氮勻漿。所得漿液于200×g離心2 min 得到第一部分細胞壁殘渣，再將上清液于15 000×g離心45 min 得到第二部分細胞器殘渣，上清液為細胞質，分離所得樣品于4 ℃保存備用。

將藍莓果肉、細胞壁殘渣、細胞器殘渣和細胞質上清液用去離子水轉入燒杯中，60 ℃烘干后加入HNO3-HC1O4（5∶1）消煮至澄清，再用去離子水定容至50 mL，采用原子吸收分光光度計測定各組亞細胞組織中的各組分Ca含量。

1.4 數據統計

每組處理中每個指標均重復測定3次，所有數據用MS-Excel?（2013）軟件處理，表示為平均值±標準偏差，用SPSS 17.0 統計軟件進行單因素方差分析（ANOVA）和Pearson相關性分析，只對差異顯著（P＜0.05）的結果進行討論分析。

2 結果與分析

2.1 輻照處理對藍莓果實硬度和果肉Ca含量的影響

如圖1-A 所示，隨著貯藏時間的延長，CK（0 kGy）組藍莓的果實硬度逐漸下降，貯藏30 d時下降到0.73 N，顯著低于1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照組。輻照處理后，藍莓果實硬度發生了不同程度的變化，其中0.5 kGy輻照處理組果實硬度變化不大，整個貯藏期間與CK組基本一致，始終處于最低的水平，而1.5 kGy和2.5 kGy輻照組果實硬度呈先上升后下降的趨勢，且在貯藏15 d時達到峰值，與CK組差異顯著。綜上，輻照能夠抑制冷藏后期藍莓果實硬度下降，且抑制效果與輻照劑量成正比。

圖1 不同輻照劑量對冷藏藍莓果實硬度和果肉鈣的影響Fig.1 Effect of different radiation doses on fruit firmness and pulp Ca content of refrigerated blueberry fruits

如圖1-B 所示，輻照處理后（貯藏0 d），各組藍莓果肉Ca 含量差異不顯著，說明藍莓果肉Ca 含量對輻照刺激的響應不積極。冷藏期間，藍莓果肉Ca含量的變化也不明顯，且各組間無顯著差異，總體水平保持在40.05～43.03 mg·100 g-1FW 之間，說明輻照對冷藏藍莓果肉Ca含量無明顯影響。

2.2 輻照處理對藍莓果實鈣結合形態的影響

如圖2-A 所示，輻照處理后（貯藏0 d），各組藍莓果實水溶性Ca 含量均有所升高，其中2.5 kGy 輻照組最高，1.5 kGy 輻照組次之，0.5 kGy 輻照組與CK 組接近，處于較低水平，說明水溶性Ca含量對輻照刺激響應積極，且其升高幅度與輻照劑量成正比。整個貯藏期間，CK組和0.5 kGy輻照組的水溶性Ca含量變化不大，始終在10 mg·100 g-1上下浮動，而1.5 kGy 和2.5 kGy輻照組的水溶性Ca 含量隨著貯藏時間的延長而快速下降，逐漸與CK 組接近，再趨于平緩。貯藏30 d 后，2.5 kGy 輻照組藍莓果實水溶性Ca 含量與0.5 kGy 輻照組和CK 組差異顯著。隨著貯藏時間的延長，輻照藍莓果實水溶性Ca可能向其他形態Ca轉變，導致其增加量有所下降，這種變化可能與果膠的去甲基程度有關。

圖2 不同輻照劑量對冷藏藍莓果實鈣結合形態的影響Fig.2 Effect of different radiation doses on calcium-binding morphology of refrigerated blueberry fruits

由圖2-B 可知，輻照處理后（貯藏0 d）各組藍莓果實NaCl溶性Ca含量略有下降，說明輻照刺激對各組藍莓果實NaCl 溶性Ca 含量影響不大。隨著貯藏時間的延長，CK組和0.5 kGy輻照組NaCl溶性Ca含量緩慢下降，而1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照組則先快速升高再趨于平緩。貯藏10～30 d，NaCl溶性Ca 含量表現為2.5 kGy輻照組＞1.5 kGy輻照組＞CK組和0.5 kGy輻照組，說明冷藏期間Ca與果膠的結合有所增加。由此可知，1.5 kGy和2.5 kGy輻照促進了冷藏藍莓果實NaCl溶性Ca的累積，但累積效果在冷藏后期逐漸減弱。

由圖2-C、D可知，HCl溶性Ca和HAc溶性Ca含量的變化比較相似，輻照處理后（貯藏0 d）均有所下降，且下降幅度與輻照劑量呈正比，這與水溶性Ca含量的變化正好相反，說明輻照處理后水溶性Ca含量的增加是由HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca 含量下降所致。整個貯藏期間，CK 組和0.5 kGy 輻照組的HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca含量基本保持不變，而1.5 kGy和2.5 kGy輻照組先快速下降，在貯藏10 d達到最低后趨于平緩，該結果與NaCl溶性Ca含量變化相反，說明冷藏期間NaCl溶性Ca 的累積與HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca 含量下降有關。

2.3 輻照處理對藍莓果實鈣亞細胞分布的影響

如圖3-A 所示，輻照處理后（貯藏0 d），冷藏藍莓果肉細胞壁Ca含量無明顯變化，說明輻照處理對細胞壁Ca 含量無直接影響。隨著貯藏時間的延長，CK 組和0.5 kGy 輻照組的Ca 含量變化不明顯，兩者之間差異不顯著，說明0.5 kGy 輻照對冷藏藍莓果肉細胞壁Ca 含量影響不大。但1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照組的Ca含量卻迅速升高，并在貯藏15 d 時分別達到峰值，之后再緩慢下降，說明1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照能夠促進貯藏前期Ca在藍莓果肉細胞壁的積累。貯藏15 d后，2.5 kGy 輻照組的細胞壁Ca 含量最高，1.5 kGy 輻照組次之，且都顯著高于CK 組，說明1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照處理提高了冷藏后期藍莓果肉細胞壁的Ca含量。

圖3 不同輻照劑量對冷藏藍莓果實鈣亞細胞分布的影響Fig.3 Effect of different radiation doses on calcium subcellular distribution of refrigerated blueberry fruits

各組藍莓果肉細胞器的Ca含量變化如圖3-B所示。CK組細胞器Ca含量在整個貯藏期間變化不大，并始終處于較高水平。輻照處理后（0 d），細胞器Ca含量隨輻照劑量的升高而下降，且處理間差異顯著（P＜0.05），說明輻照刺激能夠促進細胞器Ca的外流，且這種刺激作用與輻照劑量成正比。隨著貯藏時間的延長，0.5 kG輻照組的細胞器Ca含量變化與CK 組接近，但1.5 kGy和2.5 kGy 輻照組的細胞器Ca 含量快速下降，在貯藏15 d 達到峰谷后又緩慢升高。整個貯藏期間，細胞器Ca含量表現為2.5 kGy輻照組＜1.5 kGy輻照組＜0.5 kGy輻照組和CK組。綜上，1.5 kGy和2.5 kGy輻照處理對冷藏期間藍莓果肉細胞器Ca的外流有持續效應。

不同地，輻照處理后（貯藏后0 d），藍莓果肉細胞質Ca 含量卻逐漸升高（圖3-C），其中1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照組的細胞質Ca 含量顯著高于CK 組（P＜0.05），說明輻照刺激能夠誘導細胞質Ca 含量的升高。隨著貯藏時間的延長，0.5 kGy 輻照組細胞器Ca 含量變化不大，且與CK 組基本一致，并始終處于較高水平。但1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照組的細胞質Ca 含量卻隨著貯藏時間的延長而明顯下降，直到貯藏15 d 時才趨于平緩，說明1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照處理降低了冷藏期間藍莓果肉細胞質的Ca 含量。該結果與細胞器Ca含量變化的結果相似，但與細胞壁Ca含量變化的結果相反，由此推測，輻照處理后冷藏藍莓果肉細胞壁Ca可能來自細胞器和細胞質。

2.4 鈣形態和亞細胞鈣分布與果實硬度的關系

對不同處理組中冷藏藍莓果實硬度與不同溶解性Ca含量及細胞壁、細胞器和細胞質Ca含量的Pearson相關性進行分析，結果如表1所示。與CK組相比，0.5 kGy輻照組中不同溶解性Ca 含量與果實硬度的相關系數值無明顯變化，且兩組果實硬度與細胞壁和細胞器Ca含量分別呈正相關，而與細胞質Ca 含量均呈負相關。說明0.5 kGy 輻照處理對果實硬度與鈣形態和亞細胞鈣分布的關系影響不大。

表1 鈣形態和亞細胞鈣分布與冷藏藍莓果實硬度的Pearson相關性Table 1 Pearson correlation between calcium form and subcellular distribution with fruit firmness infrozen blueberries

1.5 kGy輻照處理后，果實硬度與鈣形態和亞細胞鈣分布的關系發生了明顯變化。不同溶解性Ca 含量與果實硬度的相關系數值均有所下降，其中水溶性Ca含量與果實硬度由負相關轉為正相關，NaCl溶性Ca含量與果實硬度由正相關轉為負相關。同時，細胞壁、細胞器和細胞質Ca 含量與果實硬度的關系也發生了轉變，且三者的相關系數值相對較小。說明1.5 kGy 輻照處理減弱了冷藏藍莓果實硬度與鈣形態和亞細胞鈣分布間的相關性，其對果實硬度的積極影響可能與其他途徑有關。

2.5 kGy 輻照處理后，不同溶解性Ca 含量與果實硬度相關系數值變化不大，但HCl 溶性Ca 含量和HAc溶性Ca含量與果實硬度均由正相關轉為負相關，且水溶性Ca 含量與果實硬度的相關性有所增強，說明2.5 kGy 輻照處理對果實硬度的積極影響與水溶Ca 含量、HCl 溶性Ca 含量和HAc 溶性Ca 含量的減少有關。同時，細胞質Ca 含量與果實硬度的關系也發生了轉變，且細胞質Ca 含量與果實硬度的相關性明顯加強。說明2.5 kGy 輻照處理對冷藏藍莓果實硬度的積極影響與亞細胞鈣分布有關。

3 討論

果實硬度作為果實的重要性狀，與細胞壁的組成和結構密切相關，而鈣對果實硬度的保持有著非常重要的作用［20-22］。鈣不僅是細胞結構的重要組成，還是傳遞胞外信號的第二使者［23-26］。植物受到外界刺激后，細胞內Ca2+的平衡狀態被打破，釋放出的多余Ca2+能夠通過靜電作用與果膠類大分子配體進行螯合，以結合態鈣存在，直接參與細胞壁的修飾，如生物紫外線光暴露和干旱脅迫都增強了植物細胞壁吸收和積累Ca2+的能力［14，27-28］。冷藏期間，輻照藍莓果肉細胞Ca形態和亞細胞鈣分布發生變化，并對果實硬度產生了截然不同的影響。其中，0.5 kGy輻照處理對冷藏藍莓果肉細胞Ca形態和亞細胞鈣分布的影響不大，且上述指標與果實硬度的關系變化也不明顯，而1.5 kGy 和2.5 kGy 輻照處理后鈣形態和亞細胞鈣分布發生了兩次不同的變化。第一次變化是輻照處理后（貯藏0 d），表現為HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca 向水溶性Ca 轉變，細胞器Ca2+流入細胞質，這可能與輻照刺激Ca2+信號傳遞有關。第二次變化是冷藏期間，表現為水溶性Ca向NaCl溶性Ca轉變，使細胞壁Ca 含量累積增加，這可能與Ca2+第二信使調控細胞壁多糖降解有關，且2.5 kGy輻照藍莓果實硬度與鈣形態和亞細胞鈣分布間的相關性較強。細胞壁上存在大量Ca2+結合位點，果膠占據了大量Ca2+結合位點，果膠的負電荷對Ca2+具有很強的吸引力，與果膠羧基以離子鍵的方式結合形成“蛋盒”結構，可以維持細胞壁的結構與功能，對果實硬度品質有積極影響［29-32］。前人研究發現，2.5 kGy輻照處理有效抑制了離子型果膠降解和解聚，保持了細胞壁結構穩定，使冷藏藍莓果實硬度保持較高水平［11］。由此推測，本研究2.5 kGy 輻照很可能介導胞內Ca2+信號，提高了細胞壁對Ca2+的吸附能力，促進Ca2+與果膠酸鹽的離子交換，使細胞器釋放的多余Ca2+被細胞壁累積，進而抑制中膠層的解體，對冷藏藍莓果實硬度產生積極的影響。但1.5 kGy 輻照組果實硬度變化與細胞壁Ca 含量升高無關，說明Ca 在細胞壁的積累需要達到一定程度才可能對果實硬度產生有效影響。

4 結論

本研究結果表明，0.5 kGy輻照處理對冷藏藍莓果實鈣的溶解性及其在亞細胞中的分布沒有影響，1.5 kGy和2.5 kGy輻照處理能夠使藍莓果實水溶性Ca含量升高，HCl 溶性Ca 和HAc 溶性Ca 含量下降，促進細胞器Ca2+流向細胞質，并在冷藏期間逐漸向NaCl 溶性Ca 轉變，被細胞壁吸附且累積，其中1.5 kGy 輻照引起的鈣形態和亞細胞鈣分布變化與冷藏藍莓果實硬度無關，但2.5 kGy 輻照處理能夠有效促進胞內Ca2+向細胞壁遷移，對冷藏藍莓果實硬度產生積極影響。