miRNA-27與宮頸癌細胞線粒體凋亡途徑的相關性△

王茜，雷正瑤，王順利，莫瓊華，易祥華,3，蔣銘華

1上海市金山區亭林醫院病理科，上海 201505

2同濟大學附屬同濟醫院病理科，上海 200065

3新疆臨床基因檢測與生物醫學信息重點實驗室，新疆 克拉瑪依 834000

4復旦大學附屬閔行醫院/上海市閔行區中心醫院婦產科，上海 201100

宮頸癌是世界范圍內病死率前五位的惡性腫瘤[1]，其發病率呈持續上升趨勢[2]，在中國宮頸癌發病例數也不斷增多[3]。宮頸癌是女性腫瘤死亡的重要原因，持續的人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是導致宮頸癌的重要原因，除HPV 感染外，包括微小RNA（microRNA，miRNA）在內的遺傳和表觀遺傳因素也參與了宮頸癌的發生。miRNA 與宮頸癌的侵襲、轉移具有密切關系，其在宮頸癌中的作用日益受到重視[4]。從功能和機制的角度來看，miRNA 已被明確在宮頸癌的診斷、治療和預后評估中具有一定作用，但還需要更全面的臨床試驗來實現基于miRNA 的診斷和治療方法的臨床轉化[5]。目前的研究普遍認為miRNA-27 在宮頸癌中表達升高，且與宮頸癌的發生發展密切相關[6]，靶向miRNA-27 能夠抑制宮頸癌進展[7]，但具體機制尚不完全明確。研究表明，miRNA 能夠調控人體約1/3 的基因，在調控腫瘤細胞凋亡的過程中起著重要甚至關鍵作用，因此成為臨床研究熱點。miRNA-27 與細胞凋亡也存在一定的關系[8]，其潛在靶點LETM1 結構域蛋白1（LETM1 domain containing 1，LETMD1）是線粒體外膜的結構蛋白組成之一[9]，在宮頸癌中的相關研究尚不充足。本研究分析miRNA-27 與宮頸癌細胞線粒體凋亡途徑的關系，探討miRNA-27 在宮頸癌中的作用網絡和機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

宮頸癌SiHa 細胞株購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI1640 培養基購自生工生物工程（上海）股份有限公司，順鉑購自上海碧云天生物技術有限公司，Trizol、miRNA熒光定量檢測試劑盒均購自Takara公司，miRNA 互補DNA（complementary DNA，cDNA）合成試劑盒、mRNA cDNA合成試劑盒分別購自生工生物工程（上海）股份有限公司和Taraka公司，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 miRNA-27 成熟體檢測及表達分析

通過檢索miRBase 數據庫[10]鑒定miRNA-27 的成熟體序列，通過miRNA 相關腫瘤生物信息Oncomir 數據庫[11]分析其在宮頸癌中的表達情況。

1.3 miRNA-27 相關靶基因分析

通過檢索常用的miRNA 數據庫miRDB、Targetscan7.2 和ENCORI[12-14]預測miRNA-27 的4 種成熟體的可能靶基因。將全部可能靶基因納入DAVID[15]分析工具，進行基因本體（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析，結合GeneMANIA 數據庫篩選與線粒體凋亡途徑直接相關的基因，并通過ENCORI 數據庫驗證所選基因與miRNA-27 表達的相關性。

1.4 構建細胞凋亡模型

以參考文獻[16]為依據，通過順鉑誘導構建宮頸癌細胞SiHa 凋亡模型（順鉑組），主要步驟如下：采用RPMI 1640 完全培養基（含10%胎牛血清）常規培養宮頸癌SiHa 細胞株，并置于37 ℃、5%CO2培養箱中，實驗前24 h 將細胞接種于6 孔板中，隨后更換為含有5 μmol/L 順鉑的培養基（提前配置），細胞繼續常規條件孵育24 h 后進行后續檢測；以無順鉑干預的細胞為空白對照組。

1.5 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測靶基因表達情況

將體外6 孔培養板中的細胞經無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗后，每孔用1 ml Trizol 裂解消化細胞，加入200 μl 氯仿振蕩混勻后，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，轉移上層水相至新離心管后加入0.5 ml 異丙醇沉淀RNA 并再次12 000 r/min、4 ℃離心15 min，隨后加入1 ml 75%乙醇溫和清洗沉淀，8000 r/min、4 ℃離心5 min后收集總RNA，進一步通過polyA 加尾法逆轉錄合成miRNA cDNA 第一鏈，將稀釋后的cDNA 通過熒光定量PCR 試劑盒進行熒光定量PCR 反應，檢測靶基因的表達情況，所有操作均按照試劑盒說明書進行。miRNA-27 分析以U6為內參，U6上游引物5'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游引物5'-GCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'；miRNA-27 上 游引物為其自身序列（miRNA-27a-3p：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3'；miRNA-27a-5p：5'-AGGGCTTAGCTGCTTGTGAGCA-3'；miRNA-27b-3p：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3'；miRNA-27b-5p：5'-AGAGCTTAGCTGATTGGTGAAC-3'），下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。LETMD1分析以β-actin為內參，β-actin上游引物5'-GTTGTCGACGACGAGCG- 3'，下游引物 5'- GCACAGAGCCTCGCCTT-3'；LETMD1上游引物5'-CGTCATTTCCCCCGCTTCTA- 3'，下游引物5'-GCATCAGCCCATAACATCTGC-3'。

1.6 統計學分析

采用GraphPad 9.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-27的成熟體序列及在宮頸癌中的表達

通過miRBase 生物信息數據庫檢索分析miRNA-27，發現hsa-miRNA-27 存在4 種成熟體hsamiRNA-27a-3p、hsa-miRNA-27a-5p、hsa-miRNA-27b-3p 和hsa-miRNA-27b-5p（表1）。隨后進一步在Oncomir 數據庫中分析這4 種成熟體的表達情況發現，在不同腫瘤中miRNA-27 存在不同的表達水平，在宮頸癌中miRNA-27 不同成熟體也存在不同的表達水平，其中hsa-miRNA-27a-3p 與hsa-miRNA-27b-3p 的表達水平明顯高于hsa-miRNA-27a-5p 和hsa-miRNA-27b-5p（圖1）。

圖1 Oncomir數據庫中miRNA-27在不同腫瘤中的表達情況

表1 miRNA-27 的成熟體序列

2.2 miRNA-27 靶基因的生物信息分析

通過miRDB、Targetscan7.2 和ENCORI 數據庫分析miRNA-27 的4 種成熟體可能的靶基因，整合上述數據庫靶基因數據并通過DAVID 進行GO 和KEGG 信號通路分析。KEGG 信號通路富集分析顯示，miRNA-27 的靶基因主要參與腫瘤的信號通路，這些通路與細胞凋亡均存在密切關系；GO 功能富集分析發現，miRNA-27 與線粒體外膜相關。（圖2）

圖2 miRNA-27靶基因GO和KEGG通路富集分析

2.3 線粒體途徑凋亡相關基因

DAVID 生物信息分析結果顯示，miRNA-27 的靶基因中有部分基因與線粒體外膜相關，可能與線粒體途徑的凋亡存在密切關系，其中包括LETMD1、酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員6（acyl-CoA synthetase long chain family member 6，ACSL6）、肉堿棕櫚酰轉移酶1B（carnitine palmitoyltransferase 1B，CPT1B）等。（圖3）

圖3 線粒體途徑凋亡相關的miRNA-27的靶基因（GeneMANIA數據庫）

2.4 miRNA-27 與LETMD1 的相關性

通過miRNA-Target CoExpression 生物信息分析發現，miRNA-27 的4 種成熟體中miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p 與LETMD1 共表達存在相關性（P﹤0.05），miRNA-27b-3p、miRNA-27b-5p 與LETMD1 共表達無相關性（P﹥0.05）。（表2）

表2 miRNA-27 的4 種成熟體與LETMD1 在宮頸癌中的共表達情況（ENCORI 數據庫）

2.5 miRNA-27a 和LETMD1 mRNA 相對表達量的比較

在上述結果的基礎上，進一步通過宮頸癌細胞凋亡模型驗證miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p 和LETMD1 的表達情況。結果發現，順鉑組中miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p 相對表達量均低于空白對照組，LETMD1mRNA 相對表達量高于空白對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表3）

表3 不同組別SiHa細胞中miRNA-27a與LETMD1 mRNA相對表達量的比較

表3 不同組別SiHa細胞中miRNA-27a與LETMD1 mRNA相對表達量的比較

組別空白對照組順鉑組t值P值miRNA-27a-3p 1.00±0.05 0.45±0.01 10.740<0.01 miRNA-27a-5p 1.00±0.13 0.63±0.01 2.902<0.05 LETMD1 mRNA 1.00±0.10 2.07±0.33 3.109<0.05

3 討論

在過去的幾十年中，miRNA 作為與人類和其他生物基因表達調控相關的重要分子，為疾病的診斷和治療提供了很多可用策略[17]。研究miRNA的分子作用機制有助于開發基于miRNA 的宮頸癌治療策略，彌補現有治療方案的不足。miRNA 作為與宮頸癌發生發展相關的生物分子，有助于病變的早期診斷[18]。

研究顯示，miRNA-27 與宮頸病變的惡性程度密切相關，存在多樣化作用方式，例如miRNA-27a可以通過靶向其下游分子調控宮頸癌細胞的惡性生物學行為[19]，miRNA-27b 可通過作用于長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）AFAP1 反義RNA 1（AFAP1 antisense RNA 1，AFAP1-AS1）/miRNA-27b-3p/血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）信號通路調控宮頸癌干細胞的狀態[20]，miRNA-27b 可影響宮頸癌細胞上皮-間充質轉化[21]。宮頸癌發生發展中一個非常重要的機制是基因調控失常導致腫瘤細胞增殖和凋亡的改變、失衡，miRNA-27 與腫瘤細胞凋亡存在密切關系[22]。據報道，在伴有HPV16 和HPV52 感染的宮頸癌及宮頸鱗狀上皮內病變患者中，miRNA-27b 表達水平升高，而在伴有HPV58 感染的宮頸癌及宮頸鱗狀上皮內病變患者中，miRNA-27b 的表達水平下調[23]；HPV16 E7 可通過促進miRNA-27b 表達上調，抑制下游分子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）的表達，促進宮頸癌細胞增殖、侵襲[24]；LINC01089 可通過調控miRNA-27a抑制宮頸癌細胞增殖[25]；lncRNA TOB1 反 義RNA1（TOB1 antisense RNA 1，TOB1-AS1）也可通過影響miRNA-27b 的表達調控宮頸癌細胞增殖、凋亡[26]。這些研究結果表明，宮頸癌細胞凋亡是宮頸癌發生發展過程中的重要機制之一。

基于細胞凋亡在宮頸癌中的重要作用，了解腫瘤細胞凋亡成為研究宮頸癌的基本思路之一，但目前的研究仍未能全面闡明細胞凋亡在宮頸癌中的作用機制，尤其是miRNA-27 通過何種機制參與宮頸癌細胞凋亡目前仍未完全清楚。本研究通過Oncomir 數據庫分析發現，miRNA-27 不同的成熟體在宮頸癌中表達水平有所差異，進一步分析其潛在的靶基因及生物學功能、信號通路等發現，miRNA-27 涉及復雜的生物學功能改變，其中包含細胞凋亡這一重要的生物學功能，提示宮頸癌細胞凋亡與miRNA-27 存在關聯。進一步的生物信息學分析篩查出與線粒體途徑凋亡最直接相關的靶基因，并選取與宮頸癌關系密切的LETMD1 進行了后續驗證。

研究表明，LETMD1在宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤中高表達，是腫瘤相關基因之一[27-28]。在細胞功能方面，LETMD1是線粒體外膜的結構蛋白組成之一[16]，因此在線粒體途徑凋亡方面具有重要作用，LETMD1 可以通過調控凋亡相關蛋白B 細胞淋巴瘤/白血病2 相關X 蛋白的表達參與乳腺癌細胞凋亡[29]。同時，LETMD1 在宮頸癌中可經由上游分子調控其表達，從而影響其功能。研究顯示，核仁小分子RNA 宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）/miRNA-194 信號通路可調控LETMD1 的表達，進而影響宮頸癌細胞凋亡、增殖等[30]。雖然miRNA-27 與LETMD1 均與細胞凋亡相關，但二者的關系及在宮頸癌中的作用仍有待明確，目前尚無文獻報道。本研究通過ENCORI 數據庫分析發現，miRNA-27 與LETMD1 存在共表達相關性，主要與miRNA-27 的成熟體miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p 相關，進一步在宮頸癌細胞SiHa 凋亡模型中發現，miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p和LETMD1存在不同程度表達改變，順鉑組中miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p相對表達量均低于空白對照組，LETMD1mRNA相對表達量高于空白對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。提示miRNA-27 與宮頸癌細胞線粒體凋亡途徑的相關性與LETMD1 密切相關。究其原因，一方面LETMD1 可能是miRNA-27的潛在作用靶點，另一方面二者均參與宮頸癌細胞凋亡過程，因此二者的共同表達、共同作用很可能是調控宮頸癌細胞線粒體凋亡途徑的重要因素。

綜上所述，本研究利用生物信息學方法對miRNA-27 的表達、功能、潛在靶基因進行了分析，發現miRNA-27 與LETMD1 可能存在相關性，提示生物信息學分析在探索宮頸癌發病機制方面具有一定的作用，可以為后續進一步研究提供有價值的研究方向及理論支撐，進一步發掘更深入的機制。