飼料及飼料原料中沙門氏菌污染狀況研究

孫玉林，謝 燦，趙雄艷，王 宇*

（1.昆明市技術合同認定登記站，云南 昆明 650021；2.官渡區水生動物監督管理站，云南 昆明 650206；3.官渡區動物疫病預防控制中心，云南 昆明 650206）

動物飼料是“從農場到餐桌”食品安全鏈的第一個環節，飼料被病原菌污染可導致人類食源性疾病。病原菌污染飼料的方式途徑不一，飼料中的沙門氏菌主要有二個來源[1]：一是原料本身攜帶有沙門氏菌，二是外源性的。既可能來自于植物性原料如大豆和谷類作物的污染、動物源性飼料如魚粉、骨粉、羽毛粉等污染、微生態制劑及酶制劑中病原菌污染及加工環境造成的交叉污染等，這些被病原菌污染的飼料進入生物體內后可通過其產品轉移、傳播，危害人類健康。沙門氏菌是一種嚴重威脅人類及動物生命健康的病原菌，被沙門氏菌污染的飼料往往是人和動物被感染的源頭。從飼料生產、經營和使用環節抽取飼料及飼料原料進行沙門氏菌檢測，以期摸清飼料中沙門氏菌的污染情況，為進一步加強和完善飼料微生物安全監測工作提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源及種類

飼料生產、經營和使用環節抽取配合飼料80批、動物性飼料原料35批包括魚粉、肉骨粉、羽毛粉和血粉，植物性飼料原料56批、微生態制劑10批、酶制劑12批、飼料生產企業加工車間粉塵5批、微生態制劑生產原料9批，樣品共計207批。

1.1.2 培養基和試劑

BPW緩沖蛋白胨水、氯化鎂孔雀綠肉湯、XLT4瓊脂、沙門氏菌顯色培養基；細菌基因組DNA快速提取試劑盒、Taq PCR Master Mix；EB、瓊脂糖、DNA Marker DL2000。

1.1.3 儀器

恒溫搖床（Thermo）、恒溫培養箱（德國Memmer）、臺式高速冷凍離心機（Sigmas）、梯度PCR儀（SENSO）、電泳儀（GE）、凝膠電泳成像分析系統（Gei Doc XR）、微生物鑒定系統（美國Sensititre）。

1.1.4 引物

以沙門氏菌invA基因為基礎，選擇特異性引物，序列為F：5＇-GTGAAATTATCGCC ACGTTCGGGCA A-3＇，R：5＇-ATCGCACCGTCAA AGGAAXX-3＇。

1.2 試驗方法

1.2.1 增菌培養

無菌稱取樣品25 g，于225 mL已滅菌的BPW肉湯中，37 ℃培養16～18 h，再取1 mL BPW增菌液于9 mL已滅菌的氯化鎂孔雀綠肉湯中進行選擇性增菌16～18 h。

1.2.2 模板DNA提取

樣品增菌液DNA的提取采用試劑盒提取，具體步驟為：

①加入150μL Buffer CS，用1 mL Tips吹打或者Vortex震蕩充分懸浮細胞沉淀→②加入5μL Proteinase K和300 μL Buffer CL，Vortex 10 s或者劇烈搖晃20次混合均勻，置于70 ℃水浴10 min。樣品為革蘭氏陽性菌和真菌可選步驟12，000×g離心2 min，將離心上清倒入或者用移液器轉入另一個干凈的1.5 mL離心管→③加入230μL無水乙醇或者95%乙醇（此時可能會出現絮狀凝集物，不影響實驗效果），溫和翻轉離心管10次混合均勻，避免產生大量泡沫，簡短離心（離心速度達到 3，000×g后立即停止）去除離心管蓋上的液體→④將步驟A4中的溶液和絮狀物一起倒入或者用移液器轉入DNA吸附柱-C30（置于收集管中）中，室溫放置1～2 min或者更長時間→⑤12，000×g離心1 min，棄收集管，將DNA吸附柱-C30放入另外一個干凈的收集管中→⑥在DNA吸附柱-C30中加入500 μL Buffer WAG，室溫放置1～2 min或者更長時間，12，000×g離心1 min，棄收集管，將DNA吸附柱-C30放入另外一個干凈的收集管中→⑦在DNA吸附柱-C30中加入500 μL Buffer WB1，12，000×g離心1 min，棄廢液，將DNA 吸附柱-C30放回收集管中→⑧重復步驟A8→⑨12，000×g 離心2 min→⑩將 DNA 吸附柱-B轉入試劑盒攜帶的1.5 mL 離心管中，向硅膠膜的中央加40～200 μL TE或者去離子水（pH≥7），將1.5 mL離心管的蓋子扣在DNA吸附柱上，做好標記，去除DNA吸附柱的蓋子。室溫放置1～2 min 或更長時間，12，000×g 離心1 min。

1.2.3 PCR檢測方法

PCR反應采用50 μL體系，組成如下為Taq PCR Master Mix 25 μL，dd H2O 18 μL，P1、P2各1 μL，模板5 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；95℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃保溫5 min；4 ℃保存。每個試樣重復2次，同時設置陰性對照、陽性對照和空白對照。

1.2.4 PCR產物的電泳檢測

配制1.5%的瓊脂糖溶液，每100 mL瓊脂糖溶液中加入5μL溴化乙錠溶液，混勻融化，稍適冷卻后制膠、電泳，電泳結束于凝膠成像系統成像。

1.2.5 細菌鑒定

將PCR檢測為陽性的樣品增菌液劃線接種于XLT4平板，挑取典型菌落進行分離純化，采用微生物鑒定系統進行鑒定。

1.2.6 檢測結果判定

PCR檢測結果為陽性，劃線接種于XLT4瓊脂獲得典型沙門氏菌菌落，經微生物鑒定系統鑒定為沙門氏菌則判定為檢出沙門氏菌。

2 結果與分析

2.1 樣品檢測結果電泳圖（圖1）

圖1 飼料及飼料原料中沙門氏菌PCR檢測電泳圖

樣品中沙門氏菌檢測PCR產物電泳圖，樣品中在陽性對照對應位置擴增出的DNA條帶，為疑似沙門氏菌陽性樣品；未擴增出的DNA條帶，為沙門氏菌陰性樣品。可看到泳道14、15及20、21對應的樣品均為疑似沙門氏菌陽性樣品，其余為沙門氏菌陰性樣品。

2.2 疑似陽性樣品平板鑒定（表1、圖2）

表1 飼料原料及產品中沙門氏菌檢測結果表

圖2 平板檢測結果圖

飼料中沙門氏菌的檢出率為3.9%，其中檢出率由高至低分別為動物性原料、微生態制劑生產原料、微生態制劑、酶制劑、濃縮配合飼料。

3 討論與結論

3.1 討 論

沙門氏菌病是公共衛生學上有重要意義的人畜共患病之一，由它引起的食物中毒在世界各國的細菌性食物中毒中常常位居前列，蛋、家畜和肉制品是主要的傳播媒介。因沙門氏菌污染餓飼料而導致畜禽大量死亡，給養殖業造成了巨大的經濟損失[2-3]。傳統的沙門氏菌檢測方法需進行非選擇性和選擇性增菌、生化及血清學鑒定很費力、耗時，需4～7 d才能完成，其他如抗體檢測法，雖然快速，但其高假陽性不適合于常規檢測[4]。此外，低水平的病原菌污染，飼料加工后導致沙門氏菌的“致傷”及飼料中其他成分的干擾等因素，使得沙門氏菌的檢測受到一些限制。因此，急需一些快速、特異、敏感的檢測方法，以及時發現致病菌，控制污染及其可能對人體健康產生的危害。隨著分子生物學技術的不斷發展和進步，針對沙門氏菌開展的快速檢測方法得到迅速發展，已經在沙門氏菌的準確、快速檢測和鑒定中起到重要作用[5]。本研究以沙門氏菌特異的invA 基因為目的片段，invA基因是與沙門氏菌侵襲作用相關的高度保守的一段序列[6-7]，核苷酸序列在沙門氏菌屬不同菌株具有較高的同源性，并且經BLAST檢索未發現與其他物種有同源關系[8]，以此建立檢測沙門氏菌的PCR法，對抽檢的飼料樣品，用PCR法和傳統的細菌分離法進行了檢測，提高了檢驗效率及靈敏度[9]。

3.2 結 論

本次監測結果顯示，動物源性飼料、飼料成品以及微生態制劑、酶制劑等都存在沙門氏菌污染的情況。動物源性飼料是畜禽飼料中沙門氏菌的主要污染源，其中以骨粉、魚粉、血粉等蛋白質飼料最易被沙門氏菌污染。飼料企業缺乏對原料和成品沙門氏菌的監測措施，對進廠的原料和出廠的產品未進行嚴格的控制，這是飼料污染沙門氏菌的重要因素之一。微生態制劑及酶制劑近年來在畜禽養殖業中得到了廣泛應用，但對于其質量及安全性評價手段較為缺乏，本次監測不僅從市場上抽取了酶制劑及微生態制劑成品，而且抽取了生產環節的各原料及輔料進行了沙門氏菌的監控，均檢出沙門氏菌。微生態制劑及酶制劑因其活性的問題不能經高溫處理，或使用高溫干燥器或擠壓蒸煮器等加熱設備殺滅細菌，經常直接用于飲水或拌料中供動物飼用，因此其安全性對于畜禽養殖業有至關重要的作用。

3.3 建 議

為了杜絕飼料被沙門菌等致病菌污染，飼料企業應加強對原料和成品的管理，不同原料和成品存放地和運輸車輛應進行專門分配和劃分，并定期消毒，對高風險的飼料原料如骨粉、血粉、羽毛粉等應提高甄別等級并與其他原料保持隔離；采取措施控制加工設備的粉塵，對粉碎和輸送設備進行對應劃分，在特定區域內發生污染時，可迅速對相關設備進行消毒等。

飼料安全是一個日益嚴重的問題，就全球而言，安全的飼料是畜牧業防止微生物污染的第一關也是最重要的一關，隨著飼料行業的發展，關于飼料安全的法律法規也將更加嚴格和健全。飼料生產企業應加強致病菌的來源、危害和預防以及相關檢驗技術的培訓，以提高企業對致病性微生物防控的能力。