孤雌產雌食胚赤眼蜂高溫敏感階段的研究

李明睿 王震剛 劉婷 匡悅 王強 李迎瑞 李博洋 劉向濤 吳雨聰 張海燕

摘要

胞內共生菌Wolbachia可誘導赤眼蜂產雌孤雌生殖，而高溫可使感染Wolbachia的赤眼蜂產雄比例增加。本文以感染Wolbachia孤雌產雌生殖的食胚赤眼蜂Trichogramma?embryophagum?為材料，采用30℃和35℃高溫處理卵、幼蟲、預蛹、蛹和成蟲等不同發育階段的蟲體，統計子代蜂發育歷期、寄生數、羽化率和性比。結果表明，與25℃對照相比，高溫縮短了子代蜂各發育階段的歷期，其中蛹、成蟲和全世代歷期顯著縮短。處理的發育階段和持續時間不同，子代的出雄率不同，而且隨著處理時間的延長，對食胚赤眼蜂子代的寄生和羽化有一定的影響。基于高溫處理后子代出雄率指標分析，F3代卵和幼蟲經高溫處理后代子代雄蜂比率最高，達到了20.54%和23.78%，明顯高于預蛹期和蛹期處理的雄蜂率。結果表明，高溫處理后感染Wolbachia的食胚赤眼蜂生殖方式改變的敏感發育階段為卵期和幼蟲期，本研究可為進一步揭示Wolbachia調控赤眼蜂生殖的機理提供理論參考。

關鍵詞

Wolbachia;?食胚赤眼蜂;?孤雌產雌生殖;?發育階段

中圖分類號：

S?476.3

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022087

Sensitive?stages?of?thelytokous?parthenogenetic?Trichogramma?embryophagum?infected?by?Wolbachia?in?response?to?high?temperature

LI?Mingrui1，?WANG?Zhengang1，?LIU?Ting1，?KUANG?Yue1，?WANG?Qiang1，?LI?Yingrui1，

LI?Boyang1，?LIU?Xiangtao1，?WU?Yucong1，?ZHANG?Haiyan1，2*

（1.?College?of?Agriculture，?Heilongjiang?Bayi?Agricultural?University，?Daqing?163319，?China;?2.?Heilongjiang

Provincial?Research?Center?for?Engineering?Technology?of?Straw?Resource?Utilization，?Daqing?163319，?China）

Abstract

The?intracellular?symbiotic?Wolbachia?can?induce?thelytokous?parthenogenesis?in?Trichogramma，?but?the?proportion?of?male?offsprings?of?Trichogramma?infected?with?Wolbachia?will?increase?after?treatment?with

higher?temperature.?In?this?study，?the?eggs，?larvae，?prepupae，?pupae?and?adults?of?infected?Trichogramma?embryophagum?were?treated?at?30℃?and?35℃.?The?developmental?duration，?parasitism?number，?emergence?rate?and?sex?ratio?of?progenies?were?calculated.?The?results?showed?that?high?temperature?shortened?the?developmental?duration?of?the?offspring，?especially?the?developmental?durations?of?pupa，?adult?and?whole?generation.?The?percentages?of?offspring?males?were?different?with?different?developmental?stages?treated?and?different?treatment?durations.?The?parasitism?and?emergence?were?changed?with?increasing?treatment?time.?Based?on?the?analysis?of?the?percentages?of?offspring?males?under?hightemperature?treatment，?the?highest?percentages?of?males?were?recorded?when?eggs?and?larvae?were?treated?in?F3?generation，?reaching?20.54%?and?23.78%，?respectively，?higher?than?those?when?prepupae?and?pupae?were?treated.?The?results?suggested?that?the?changes?of?reproductive?pattern?of?T.embryophagum?induced?by?Wolbachia?were?most?sensitive?to?hightemperature?treatment?at?egg?and?larval?stages.?This?study?provides?a?theoretical?reference?for?further?revealing?the?reproductive?mechanism?of?Trichogramma?associated?with?Wolbachia?infection.

Key?words

Wolbachia;?Trichogramma?embryophagum;?thelytokous?parthenogenesis;?developmental?stage

節肢動物胞內共生細菌沃爾巴克氏體Wolbachia廣泛存在于自然界中［1］，可通過宿主細胞質（非細胞核遺傳）向宿主子代垂直傳播［2］。Wolbachia?可改變宿主生殖方式，誘導宿主細胞質不親和（cytoplasmic?incompatibility，CI）（包括單向不親和與雙向不親和）［35］、孤雌生殖（parthenogenesis?inducing，PI）［產雄孤雌生殖（arrhenotoky，AY）與產雌孤雌生殖（thelytoky，TY）］［67］、遺傳雄性的雌性化（feminization）［8］、雄性致死（malekilling）［9］等。近十年來，Wolbachia?改變宿主生殖方式的現象在蛛形綱、等足目和一些昆蟲中均有報道［1014］。例如，Wolbachia?pipientis可調控赤眼蜂發生孤雌產雌生殖［15］，同時Wolbachia的殺雄、胞質不親和等特性也可以應用到其他昆蟲中，這對改良天敵種群具有重要意義［1617］。

赤眼蜂是一類廣泛應用于害蟲生物防治的卵寄生蜂。其中，孤雌產雌生殖的赤眼蜂無需交配即可產下近100%的子代雌蜂，因此無需飼養雄蜂，大幅節約了生產成本［18］。目前已知Wolbachia可感染約20種赤眼蜂，如松毛蟲赤眼蜂Trichogramma?dendrolimi、短管赤眼蜂T.pretiosum、螟黃赤眼蜂T.chilonis

、食胚赤眼蜂T.embryophagum和安荔赤眼蜂T.oleae等［1921］。研究發現，高溫和抗生素對赤眼蜂體內Wolbachia影響顯著，超過28℃的高溫可使子代蜂出現雄性，且溫度越高、處理時間越長子代蜂雄性比例越高［22］。此外，喂食抗生素也可使感染Wolbachia的赤眼蜂生殖方式部分或完全恢復為兩性生殖［23］。研究發現，Wolbachia誘導的赤眼蜂產雌孤雌生殖現象取決于Wolbachia的滴度［24］，本課題組前期研究發現，除了滴度因素外，高溫（30℃以上）會影響Wolbachia對宿主赤眼蜂生殖方式的調控。

本研究采用25、30℃和35℃分別處理食胚赤眼蜂各發育階段（卵、幼蟲、預蛹、蛹和成蟲），通過調查處理后子代蜂生殖表型，明確高溫對Wolbachia調控赤眼蜂產雌孤雌生殖方式產生影響的關鍵階段。研究結果將有助于揭示Wolbachia調控赤眼蜂生殖表型發生改變的機理。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

蜂種：感染Wolbachia的孤雌產雌食胚赤眼蜂Trichogramma?embryophagum?（Hartig）由廣東省農業科學院提供，在黑龍江八一農墾大學農學院養蟲室飼養80代以上。

寄主米蛾卵：黑龍江八一農墾大學農學院養蟲室飼養的米蛾Corcyra?cephalonica（Stainton）所產新鮮卵。

1.2?試驗方法

蜂種保種：將天然桃樹膠均勻地涂抹在滅菌濾紙上，將新鮮米蛾卵均勻地灑在上面，在距離紫外燈10?cm處滅菌10?min，接蜂后將蜂卡置于25℃，相對濕度為70%的恒溫培養箱內保種繁殖。

不同溫度下感染Wolbachia的食胚赤眼蜂各階段發育歷期：取單頭食胚赤眼蜂雌蜂，置于玻璃指形管內，給予含足量新鮮米蛾卵的卵卡（超過200粒米蛾卵），用棉花塞住管口，轉移至25、30、35℃的人工氣候箱中恒溫培養，相對濕度均為70%，光周期為L∥D=12?h∥12?h。每隔8?h觀察1次食胚赤眼蜂發育情況，統計卵期、幼蟲期、預蛹期、蛹期和成蟲期持續時間。

短期高溫處理方法：取初羽化成蟲60頭，每15頭為1組，每頭單獨放入一個小指形管內，放入新鮮卵卡（約200粒卵）供其寄生。試驗分別設卵期、幼蟲期、預蛹期和蛹期進行30℃或35℃高溫處理，以25℃為對照溫度。卵期高溫處理：將接入卵卡的指形管轉移到30℃或35℃，相對濕度70%的恒溫培養箱中培養，寄生8?h去除種蜂，待寄生蜂卵期結束（去除種蜂后約1?d），將指形管重新放回25℃，相對濕度70%的條件下培養，當被寄生的米蛾卵變黑（此時赤眼蜂發育至蛹期）時從每組的卵卡（15張卵卡每張卡上取1～2粒）上隨機挑取15粒以上待羽化出蜂的米蛾卵，用于出蜂后下一代的處理。幼蟲期、預蛹期和蛹期的高溫處理：接入卵卡的指形管在25℃，相對濕度70%的條件下培養8?h后去除種蜂，待卵發育至幼蟲初期（去除種蜂后約2?d）、預蛹期（去除種蜂后約4?d）和蛹期（去除種蜂后約5?d）時?，將指形管分別放入30℃或35℃，相對濕度70%的恒溫培養箱中培養，其中幼蟲和預蛹在高溫下均處理1?d，蛹期處理3?d，而后將指形管重新放回25℃，相對濕度70%的條件下培養。羽化出蜂后代按上述方法繼續處理，其中第1次處理的蜂為F0代，經高溫處理1次后獲得的子代蜂為F1代，第2次處理后羽化子代蜂為F2代，依次類推統計至F3代出蜂。

統計每一子代寄生數、羽化數，統計羽化率、雄蜂率。

寄生數為米蛾卵被寄生變黑的數量。

羽化率=羽化出蜂數/寄生卵粒數×100%;雄蜂率=羽化雄蜂數/羽化出蜂數×100%。

1.3?數據統計與分析

調查記錄的試驗數據經?Excel?整理后，不同處理的寄生數、發育歷期均值首先進行單因素方差分析，對存在顯著性差異的數據進一步采用?Duncan?氏新復極差法進行多重比較。羽化率及雄蜂百分率數據轉換后再進行分析。顯著性水平α=0.05。

2?結果與分析

2.1?孤雌產雌食胚赤眼蜂的發育歷期

通過顯微鏡觀察孤雌產雌赤眼蜂各發育階段的特征及歷期，結果見表1。

由表1可知，與25℃相比，30℃和35℃下食胚赤眼蜂蛹、成蟲和全世代

歷期均顯著縮短，而兩個高溫處理之間赤眼蜂各階段的發育歷期無顯著差異。

2.2?高溫處理后孤雌產雌食胚赤眼蜂的生物學特性

2.2.1?高溫處理食胚赤眼蜂不同發育階段后各代的寄生、羽化情況

由表2可知，食胚赤眼蜂F0代卵、幼蟲、預蛹和蛹經過30℃或35℃高溫處理后，F1代的寄生數（19.61～22.86粒）、羽化率（64.43%～87.86%）與未經高溫處理的對照（25℃）的寄生數和羽化率（23.88粒和81.04%）相比均無顯著差異，35℃預蛹期處理的羽化率為87.86%，顯著高于該溫度下卵和幼蟲處理后，以及30℃處理各階段后F1代蜂的羽化率。30℃處理卵、幼蟲、預蛹和蛹后F1代蜂的羽化率沒有顯著差異。

由表3可知，食胚赤眼蜂同一發育階段經過連續兩代30℃或35℃高溫處理后，F2代的寄生數與25℃對照相比均沒有顯著差異，但30℃和35℃的卵處理其F2代的寄生數差異顯著，分別為19.47粒和28.77粒，其他階段經高溫處理后F2代寄生數均無顯著差異。30℃處理預蛹后F2代的羽化率最低，為66.35%，顯著低于其他處理。35℃處理卵和幼蟲，F2代羽化率分別為86.17%和84.27%，顯著高于25℃時的羽化率。

由表4可知，食胚赤眼蜂同一發育階段經過連續三代的高溫處理后，除了30℃蛹處理的F3代寄生數為20.54粒，顯著低于35℃預蛹處理外，其他各處理間及與對照間F3代的寄生數均無顯著差異。羽化率統計結果表明，30℃卵處理F3代羽化率最低，為60.78%，其次為35℃預蛹處理，羽化率為61.54%，兩者顯著低于30℃蛹處理和35℃其他階段的處理。35℃幼蟲處理后羽化率最高，為83.45%，顯著高于30℃卵、幼蟲和預蛹處理。

2.2.2?食胚赤眼蜂各個發育階段高溫處理后子代的雄蜂率

研究發現，在25℃下，食胚赤眼蜂孤雌產雌，子代沒有雄性個體出現，不同發育階段蟲體經30℃和35℃高溫處理后，子代均羽化出雄蜂。卵、預蛹和蛹連續3代經30℃處理，隨著連續處理代數增加，子代雄蜂率明顯增加，其中卵處理后子代雄性個體比例隨著處理代數增加而顯著增加，到F3代雄蜂率最高，為20.54%（圖1），幼蟲期處理后子代F2代雄蜂率最高，也在20%左右，與F3代沒有顯著差異，但顯著高于F1代的雄蜂率。比較同一世代的各處理之間的雄蜂率，可以看出，F1代、F2代的雄蜂率均以幼蟲期處理較高，但F3代的雄蜂率以卵處理最高，F3代的卵、幼蟲、預蛹處理的雄蜂率間沒有顯著差異，但三者均明顯高于蛹期處理的雄蜂率。

卵、幼蟲和蛹連續3代經35℃處理，隨著處理代數的增加，子代雄蜂率增加，其中幼蟲處理后子代雄性個體比例隨著處理世代增加而顯著增加，到F3代雄蜂率最高達23.78%（圖2），卵處理的F1代和F3代間雄蜂率差異顯著，F3代卵和幼蟲處理的雄蜂率顯著高于預蛹和蛹期處理的雄蜂率。

3?結論與討論

關于溫度對感染Wolbachia的赤眼蜂的影響已有較多研究，其中高溫可以改變感染Wolbachia赤眼蜂的生殖特性也有報道［25］，但高溫誘導孤雌產雌赤眼蜂生殖發生改變的敏感發育階段至今沒有報道，明確高溫改變赤眼蜂生殖方式的敏感發育階段，對于研究孤雌產雌赤眼蜂生殖具有重要意義。孤雌產雌的松毛蟲赤眼蜂Trichogramma?dendrolimi經短期高溫刺激，尤其是38℃高溫刺激后羽化出蜂率和單卵出蜂數明顯降低，其子代蜂各指標變化不明顯，二代赤眼蜂均未有雄蜂出現，說明短期高溫沖擊沒有對?Wolbachia?調控其宿主生殖方式的作用產生影響［26］。?隨著溫度的升高赤眼蜂體內的Wolbachia滴度會降低，在28℃到31℃中滴度隨著代數的增加先下降后上升，雄蜂百分率和雌雄間體百分率卻隨著代數的增加呈先上升后下降再上升的趨勢［29］。根據試驗結果和現象推斷，高溫會促使感染Wolbachia的赤眼蜂由孤雌產雌轉變為孤雌產雄;過高和過長的溫度處理會降低Wolbachia對赤眼蜂的作用;所以適當的短時高溫和選擇不同發育階段進行處理是本試驗進行的關鍵。本研究連續高溫處理3個世代，孤雌產雌品種食胚赤眼蜂生殖方式有所改變，而根據張海燕等［28］、潘雪紅等［25］及寧素芳等［29］對不同種孤雌產雌赤眼蜂的研究，高溫對松毛蟲赤眼蜂和短管赤眼蜂的出雄率變化的影響較明顯的結論略有不同，是否與食胚赤眼蜂體內Wolbachia菌系或赤眼蜂種類對高溫的耐受性有關需進一步試驗進行驗證。

除了高溫以外，其他外界環境因子如抗生素、交配等誘導孤雌產雌赤眼蜂生殖方式發生改變也有報道［25］。不同溫度下與雄蜂交配不會改變?Wolbachia?感染引起的松毛蟲赤眼蜂產雌孤雌生殖方式，抗生素處理和持續至少?20?d?的?32℃高溫是改變感染?Wolbachia?的松毛蟲赤眼蜂生殖方式的決定因素［27］。本試驗孤雌產雌的食胚赤眼蜂各發育階段在經過短期30℃和35℃高溫處理后，子代出現了雄蜂，且處理的發育階段不同、世代不同，子代恢復出雄的比率也不同，處理代數越多子代出現雄蜂的幾率越大。短期高溫處理卵和幼蟲后生殖方式改變即出雄的幾率較大，尤其是幼蟲處理后變化較明顯，預蛹期和蛹期高溫處理后出雄率

變化不大，只有個別世代出現變化。說明高溫對Wolbachia誘導赤眼蜂生殖改變的影響主要發生在卵期和幼蟲期。田間釋放赤眼蜂防治害蟲的時候，都是選擇赤眼蜂即將羽化出蜂的時期，所以田間生產應用過程中如遇高溫不會影響寄生效果，這一研究結果為生產上釋放孤雌產雌的赤眼蜂提供了參考。

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