miR-20b-5p與TGFBR2在宮頸癌組織中的表達及意義

汪瑩 申復進 李洋 馮丹 劉婷婷 廖文欣

宮頸癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一,近年來發病呈年輕化的趨勢[1]。隨著HPV疫苗的普及和宮頸癌篩查手段提升,患者得以早診斷早治療,但局部晚期宮頸癌患者由于發生淋巴結轉移導致預后不良[2]。目前,宮頸癌轉移的相關機制尚未明確,需要尋找更為合適的分子靶點為臨床診斷和治療提供參考依據。MicroRNA(miRNA)是一類長度為18～25 nt非編碼小RNA,常與靶基因mRNA3’ UTR內的部分互補序列結合,通過轉錄后水平沉默靶基因功能來影響多個生物過程,包括細胞增殖、侵襲和轉移等[3]。研究表明miR-20b-5p在不同腫瘤中有著促癌或抑癌的作用,其在肺癌[4]、喉癌[5]等大多數實體瘤中發揮促癌作用,而在結腸癌[6]、腎細胞癌[7]等腫瘤中發揮抑制腫瘤生長的作用。然而,miR-20b-5p在宮頸癌中的功能機制尚不明確。Qi等[8]研究發現在前列腺癌中2型轉化生長因子β受體(TGFbeta type Ⅱ receptor,TGFBR2)是miR-20b-5p的靶基因,miR-20b-5p/TGFBR2/E2F1軸誘導前列腺癌細胞的上皮向間質轉化。TGFBR2是TGF-β直接結合并發揮作用的受體,具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性[9]。TGFBR2作為TGF-β信號通路中發揮作用的關鍵分子,是重要的腫瘤抑制因子[10]。研究發現TGFBR2在直腸癌[11]、卵巢癌[12]、肺癌[13]等實體瘤中呈低表達,其表達喪失則促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲。Yuan等[14]研究發現TGFBR2在宮頸癌細胞中呈低表達,其通過阻斷Hedgehog通路抑制宮頸癌細胞增殖、遷移。本研究探討miR-20b-5p和TGFBR2在宮頸癌組織中的表達情況及與臨床病理特征的關系,尋找宮頸癌轉移監測的新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年10月我院診治的宮頸癌患者58例。年齡32～65歲,平均年齡(51.52±10.33)歲。納入標準:(1)經術后病理學確診為宮頸癌;(2)均未接受過化療、放療等抗腫瘤治療;(3)臨床資料完整。排除標準:(1)合并其他系統惡性腫瘤;(2)接受過化療、放療、免疫治療等;(3)臨床資料不完整或缺失;(4)合并重要器質性病變。選取32例同期因子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除術的正常宮頸組織為對照組,年齡35～67歲,平均年齡(51.47±9.03)歲。2組患者年齡差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核并批準,所有患者術前簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR(RT-PCR)檢測2組宮頸組織中miR-20b-5p和TGFBR2 mRNA表達水平:TRIzol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)提取組織中總RNA,使用分光光度儀檢測組織樣本RNA的純度,選用A260/A280在1.8～2.0間RNA樣本進行反轉錄,根據逆轉錄試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,貨號:1139ES60)說明,將RNA逆轉錄為cDNA。miR-20b-5p內參為U6,TGFBR2內參為GAPDH,以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。采用qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,貨號:1141ES),以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系:95℃預變性2 min,1個循環;95℃變性10 s,60℃退火/延伸30,40個循環。引物由上海生物工程股份有限公司合成。miR-20b-5p正向引物序列為5’-GCGCAAAGTGCTCATAGTGC-3’,反向引物序列為5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。TGFBR2正向引物序列為5’-CTTTGGGCTTTCCCTGCGT-3’,反向引物序列為5’-TGTCATTTCCCAGAGCACCAG-3’。U6正向引物序列為5 ’-AGCACATATACTAAAATTGGAA

CGAT-3’,反向引物序列為5’-ACTGCAGGGTCCGAGG

TATT-3’。GAPDH正向引物序列為5’-GGAAGCTTGT

CATCAATGGAAATC-3’,反向引物序列為5’-TGATGA

CCCTTTTGGCTCCC-3’。

1.2.2 Western blot檢測2組宮頸組織中TGFBR2蛋白表達:2組宮頸組織塊用預冷的PBS緩沖液漂洗2～3次,剪成小塊置于勻漿器中。加入RIPA裂解液(大連美侖生物技術有限公司)裂解,冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉移至離心管中,振蕩。冰浴30 min,期間用移液器反復吹打,確保勻漿液完全裂解。4℃下13 000 g離心5 min,收集上清(蛋白)。采用BCA蛋白質濃度測定試劑盒(武漢科瑞生物技術有限公司)測定樣品蛋白濃度后,在蛋白樣品中加入適當量的5×蛋白上樣緩沖液(大連美侖生物技術有限公司),95～100℃沸水浴5 min。按檢測濃度進行上樣,電泳分離蛋白后再轉膜,在5%脫脂牛奶中封閉1 h。加入已稀釋好的TGFBR2兔抗人單克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號:AF5449)4℃過夜,用TBST洗3次,5 min/次,加入稀釋好的辣根過氧化物酶偶聯二抗(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:GB23303),室溫孵育30 min,用TBST室溫下搖床上洗4次,5 min/次。滴加ECL混合溶液(武漢科瑞生物技術有限公司),暗室中曝光。Image J軟件對蛋白定量進行分析。

1.2.3 免疫組化檢測2組宮頸組織中TGFBR2:免疫組化染色采用鏈霉親和素-生物素復合物技術法(SP法),將組織石蠟包埋并切片,切片在60℃烤箱內烘烤后進行二甲苯脫蠟, 乙醇脫水后沖洗,抗原修復、血清封閉、一抗及二抗孵育、DAB顯色液進行顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片。TGBFR2兔抗人單克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號:AF5449),SP試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司,貨號:KIT-5920)。由我院病理科醫師在光學顯微鏡(200×)下盲法閱片拍照,以細胞質中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性染色,否則為陰性表達。

1.2.4 miR-20b-5p和TGFBR2結合位點預測:通過https://www.targetscan.org/vert_80/在線網站預測miR-20b-5p和TGFBR2的靶向結合位點。

2 結果

2.1 2組宮頸組織中TGFBR2蛋白表達 TGFBR2在宮頸癌組中表達水平顯著低于對照組(t=9.24,P<0.001);TGFBR2在宮頸癌組中表達水平顯著低于對照組(t=13.27,P<0.01)。見圖1,表1。

表1 2組TGFBR2蛋白表達水平

圖1 宮頸癌組和對照組宮頸組織中TGFBR2蛋白表達情況;A Western blot檢測TGFBR2蛋白表達及量化分析;B 免疫組化染色檢測對照組中TGFBR2的表達情況(×200);C 免疫組化染色檢測宮頸癌組中TGFBR2的表達情況(×200)

2.2 2組宮頸組織中miR-20b-5p和TGFBR2 mRNA表達情況 宮頸癌組中miR-20b-5p表達量顯著高于對照組(t=10.81,P<0.01),而TGFBR2 mRNA表達量顯著低于對照組(t=10.19,P<0.01)。見表2。

表2 2組宮頸組織中miR-20b-5p、TGFBR2 mRNA的表達情況

2.3 miR-20b-5p和TGFBR2 mRNA表達水平的相關性分析 通過Targetscan在線網站預測miR-20b-5p和TGFBR2基因的靶向結合位點,顯示miR-20b-5p與TGFBR2的3’UTR存在結合位點,Pearson相關性分析發現宮頸癌組織中miR-20b-5p與TGFBR2 mRNA表達呈負相關,差異有統計學意義(r=-0.7366,P<0.0001)。見圖2。

圖2 miR-20b-5p和TGFBR2 mRNA表達水平的相關性分析;A miR-20b-5p和TGFBR2的靶向結合位點;B 宮頸癌組織中miR-20b-5p與TGFBR2 mRNA表達的相關性分析

2.4 miR-20b-5p、TGFBR2表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 根據miR-20b-5p和TGFBR2表達水平的均值將宮頸癌患者分為miR-20b-5p低表達組、miR-20b-5p高表達組、TGFBR2低表達組和TGFBR2高表達組。發現miR-20b-5p表達水平與宮頸癌患者的FIGO分期、淋巴結轉移顯著相關(均P<0.05),與年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小無相關性(P>0.05)。TGFBR2表達水平與宮頸癌患者的分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移相關(P<0.05),與年齡、病理類型、腫瘤大小無相關性(P>0.05)。見表3。

表3 miR-20b-5p、TGFBR2表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 例(%)

3 討論

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染是宮頸癌發展的主要驅動因素,嚴重損害女性生命健康[15]。近年來早期宮頸癌治療效果較好,但局部晚期宮頸癌由于轉移或化療耐藥等導致臨床治療效果不理想。因此,進一步探索宮頸癌的轉移機制,尋找潛在的干預靶點,對提高復發轉移性宮頸癌的治療效果至關重要。

隨著對miRNA相關研究的深入,miRNA通常在轉錄后水平調控靶基因mRNA的表達以影響細胞的增殖、侵襲等生物學功能。研究發現miRNA在肺癌[16]、乳腺癌[17]等多種惡性腫瘤中呈異常表達,與腫瘤的進展、轉移、耐藥性及預后密切相關。miR-20b-5p來源于miR-17基因家族,先前已被報道參與肺癌[18]、結直腸癌[19]等實體瘤的發生發展、轉移、耐藥等。據研究表明,在肝細胞癌(HCC)組織中miR-20b-5p呈顯著高表達,過表達的miR-20b-5p通過靶向下調胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白3(CPEB3)表達進而促進HCC細胞增殖、遷移和侵襲[20]。miR-20b-5p在乳腺癌細胞中高表達,miR-20b-5p通過雙向調節細胞周期蛋白D1(CCND1)和E2F轉錄因子1(E2F1)促進乳腺癌細胞增殖、侵襲并抑制凋亡[21]。miR-20b-5p在HCC和乳腺癌中呈高表達,在其腫瘤發生發展過程中發揮促癌基因功能。本研究結果顯示,宮頸癌組織中miR-20b-5p表達量顯著高于正常宮頸組織(P<0.001),提示miR-20b-5p可能在宮頸癌中發揮促癌因子作用,參與調控宮頸癌的發生發展。Yu等[22]研究發現在食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中miR-20b-5p表達顯著高于鄰近食管正常組織,miR-20b-5p表達水平與淋巴結轉移、晚期ESCC分期呈顯著相關(P<0.05)。Pantazis等[23]研究發現在喉鱗狀細胞癌中miR-20b-5p高表達的患者較miR-20b-5p低表達的患者更容易復發,且低表達miR-20b-5p的患者預后更好。與上述研究結果相似,本研究通過分析miR-20b-5p和宮頸癌患者臨床病理特征的關系顯示,miR-20b-5p表達水平與宮頸癌患者的FIGO分期、淋巴結轉移顯著相關(P<0.05),與年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小無顯著相關(P>0.05),可見miR-20b-5p可能參與晚期宮頸癌的淋巴轉移。

TGFBR2是TGF-β信號通路中的關鍵分子,其編碼基因位于3p22。已有研究報道TGFBR2在非小細胞肺癌[24]、胃癌[25]等惡性腫瘤中發揮抑癌因子作用,抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移。Yuan等[26]研究發現與正常宮頸上皮細胞相比,TGFBR2在宮頸癌細胞系(HeLa、SiHa、CaSk、C33A)中呈低表達,但在宮頸癌組織的表達情況尚不清楚。本研究結果顯示,宮頸癌組織中TGFBR2的表達量顯著低于正常宮頸組織(P<0.001),提示TGFBR2可能參與宮頸癌發展,發揮抑癌因子作用。本研究通過分析TGFBR2表達水平與宮頸癌患者的臨床病理特征的關系發現TGFBR2表達與宮頸癌患者的分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移顯著相關(P<0.05),與年齡、病理類型、腫瘤大小無顯著相關(P>0.05),提示TGFBR2低表達可能與宮頸癌增殖、淋巴結轉移密切相關。根據Targetscan網站預測發現TGFBR2和miR-20b-5p具有靶向結合位點。本研究結果顯示,宮頸癌組織中miR-20b-5p與TGFBR2 mRNA表達呈負相關(r=-0.7366,P<0.01)。這提示miR-20b-5p與TGFBR2可能存在靶向調控關系共同參與宮頸癌的轉移過程。

綜上所述,在宮頸癌組織中miR-20b-5p呈高表達,TGFBR2呈低表達,兩者表達呈負相關。miR-20b-5p、TGFBR2表達水平與宮頸癌FIGO分期、淋巴結轉移密切相關,為評估宮頸癌的淋巴結轉移和預后提供參考價值。