扎那紋胸鮡g型溶菌酶的cDNA克隆及組織表達分析

王運嬌,呂 夢,蔡莎莎

溶菌酶最初以水解細胞壁而聞名[1],根據分子結構、催化機制及免疫特性的不同,動物溶菌酶分為3種:c型溶菌酶、g型溶菌酶和i型溶菌酶[2]。魚類溶菌酶主要有c型溶菌酶和g型溶菌酶2種,且這2種類型的溶菌酶在組織分布、基因組結構和分子特征方面都存在很大的不同[2]。目前針對魚類溶菌酶的研究主要集中在c型,對g型溶菌酶的報道局限于鯉形目鯉魚、草魚[3],鱸形目石首魚科、鮨科[4],鱘形目鱘科[5],鰈形目牙鲆科和鱈形目鱈科[6]等。目前尚無關于鲇形目鮡科魚溶菌酶的報道研究。扎那紋胸鮡隸屬鮡科、紋胸鮡屬主要分布于我國瀾滄江中游及怒江上中游水網系統,是當地重要的經濟漁獲之一[7]。近年來,由于過度捕撈、棲息地退化或環境污染,該物種的自然種群數量急劇下降,引起人們對其長期可持續性的日益關注。人工馴養是保護扎那紋胸鮡種質的一種可行方式,但目前扎那紋胸鮡的人工養殖技術還不成熟,難以實現規模化,且常有各種感染性疾病的發生。鑒于溶菌酶在魚類感染性疾病控制中的重要作用[8],該研究利用PCR克隆和生物信息學的方法分析鑒定了扎那紋胸鮡g型溶菌酶(G.zainaensisg-typeLysozyme,GzLysG)基因,并利用實時定量PCR技術分析了其在扎那紋胸鮡不同組織中的表達特征,為進一步闡明g型溶菌酶在扎那紋胸鮡免疫防御抵抗病原菌中的功能奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物扎那紋胸鮡6條,4雄2雌,體質量100～200 g,采自四川怒江,液氮速凍,干冰運輸。解剖取其肝臟、腸、肌肉、鰓、皮膚和脾臟組織,置于液氮中,保存備用。

1.2 藥品與試劑TRIzol RNA分離試劑購自美國Invitrogen公司;SMARTTM cDNA Library Construction Kit(Clontech)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、TB Green?Premix DimerEraserTM(Perfect Real Time)以及PCR克隆用的Taq酶均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;引物合成、測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1扎那紋胸鮡溶菌酶基因的克隆 利用TRIzol RNA分離試劑提取扎那紋胸鮡肝臟組織總RNA,分別利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop GX分光光度計分析RNA的完整性和純度。選以高質量的RNA為模板,嚴格按照說明書要求,利用建庫試劑盒SMARTTM cDNA Library Construction Kit構建cDNA文庫。參考已知魚類g型溶菌酶的基因序列,借助Primer Premer 5.0在線軟件,設計兩條5′上游引物(P1:5′-ATGGCTKGCATTTTTGGAGAC-3′,P2:5′-ATGATCTGAAGARGATGGA-3′),然后利用試劑盒內的CDSⅢ/3′PCR Primer為3′隨機引物進行目的基因的PCR克隆,挑選陽性克隆測序,將測序結果序列與NCBI數據庫中的序列進行比對鑒定分析。

1.3.2生物信息學分析 使用ExPASy中的Translate軟件(https://web.expasy.org/translate/)推導氨基酸序列。對推導的氨基酸序列,利用SignalP 5.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)進行信號肽的查找分析。利用在線軟件ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)對溶菌酶序列的理化性質進行分析。利用CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析溶菌酶的保守結構域。在NCBI中查找已報道的其他物種來源的溶菌酶的序列信息,利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在線軟件對扎那紋胸鮡溶菌酶與其他物種的氨基酸序列進行多物種序列比對。利用MEGA 6.0軟件,選以鄰接法構建系統發育樹,參數設置選擇Poisson Correction 模型,bootstraps設置為 1 000[9]。

1.3.3結構分析 利用在線預測軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白的二級結構。利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預測扎那紋胸鮡溶菌酶的高級結構。

1.3.4組織表達譜分析 按照“1.3.1”所述方法提取扎那紋胸鮡脾臟、肝臟、腸、肌肉、鰓和皮膚6個組織的總RNA,然后按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒說明書,合成cDNA一鏈序列。反轉錄的cDNA模板用EASY Dilution稀釋10倍后使用。利用Primer Premer 5.0軟件設計扎那紋胸鮡溶菌酶基因和內參基因β-actin的引物。GzLysG的上下游引物分別為5′-AGTACAAGGCCACCATCGTC-3′和5′-TCACTGTTCCAGGCTCCTTT-3′,β-actin的上下游引物分別為5′-GCTGTCTTCCCTTCCATTGT-3′和5′-CTGAGCCTCATCACCAACAT-3′。按照TB Green?Premix DimerEraserTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書在QuantStudio 7 Flex real-time PCR System(Applied Biosystems, USA)上進行qPCR反應。反應體系為:12.5 μl的TB Green Premix DimerEraser(2×),0.75 μl的PCR Forward Primer(10 μmol/L),0.75 μl的PCR Reverse Primer(10 μmol/L),2 μl的模板cDNA,9 μl的滅菌雙蒸水。qPCR的反應條件為:95 ℃預變性30 s;40個循環,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s。各樣品的目的基因反應產物經熔解曲線確認是否為單一特異性的擴增條帶。目的基因的轉錄水平變化采用ΔΔCt法分析處理。

2 結果

2.1 GzLysG cDNA的克隆及分子特征以肝臟總RNA為模板,利用巢氏PCR技術,成功克隆到一條編碼GzLysG的全長cDNA序列(GenBank登錄號:OP881998, 圖1)。按照溶菌酶的類型和扎那紋胸鮡拉丁名G. zainaensis的前兩個首字母將克隆得到的溶菌酶命名為GzLysG。GzLysG的cDNA序列全長558 bp,編碼185個氨基酸(圖1)。蛋白保守功能結構域的預測結果表明,GzLysG含有g型溶菌酶典型的鵝蛋清溶菌酶(goose egg white lysozyme, GEWL)結構域和可溶性裂解轉糖苷酶(soluble lytic transglycosylases, SLT)結構域。

圖1 GzLysG cDNA及其編碼的氨基酸序列紅色字體為半胱氨酸殘基;黃色陰影為糖結合位點;框中為SLT結構域

GzLysG蛋白無信號肽序列,表明該溶菌酶為非分泌表達的蛋白質(圖2)。GzLysG蛋白的氨基酸序列中含有20種常見氨基酸,其中Lys的含量最高(11.9%),其次是Gly (10.8%)和Ala(8.1%)。其分子量為20 478.20 u,理論等電點為9.16,經ExPASy-ProtParam分析判斷為一種穩定的堿性親水性蛋白質。

圖2 GzLysG的信號肽分析

2.2 多物種溶菌酶基因序列比對多物種序列比對結果發現,GzLysG與日本鰻鱺(AJLysG2)和斑馬魚(DRLysG)來源的溶菌酶的同源性相對較高。且在GzLysG序列中也發現了g型溶菌酶高度保守的催化活性位點Glu(E73)、Asp(D86)和Asp(D97)(圖3)。

圖3 GzLysG與其它代表性g型溶菌酶的多物種序列比對綠色陰影為高度保守的氨基酸,黃色陰影和星號指示催化位點殘基

2.3 GzLysG的結構特征分析GzLysG二級結構中含有6個大小不一的α螺旋結構,占比43.24%,β折疊占比11.35%,β轉角占比4.86%,無規則卷曲結構占比40.54%(圖4A)。Swiss model模型進一步驗證了上述結果,GzLysG與鵝蛋蛋白溶菌酶(PDB:153l.1.A)結構相似,都有6個α螺旋結構(圖4B)。3D結構模型顯示,GzLysG分子表面有一條較深的裂縫,催化活性中心的3個殘基均勻地分布在裂縫的兩側(圖4B)。溶菌酶的這種特殊結構與其酶活性催化機制密切相關。

圖4 GzLysG的結構預測結果

2.4 物種間溶菌酶的進化關聯分析基于溶菌酶分子的蛋白序列,構建了扎那紋胸鮡與其他物種來源的溶菌酶的系統發生樹。結果如圖5所示,根據進化的親緣關系,系統發生樹可以被分為3個分支,c型溶菌酶,i型溶菌酶和g型溶菌酶。其中,GzLysG與斑馬魚來源的溶菌酶表現出較近的親緣關系,且與其他物種的g型溶菌酶聚為一支。此外,通過進化發生樹,還能發現不同物種的g型溶菌酶之間存在同一性高的特點,即使是同一物種的g型和c型溶菌酶也存在各自的同一性和差異性。

圖5 GzLysG的進化分析

2.5 GzLysG基因的組織表達譜分析以β-actin基因為內參,利用實時定量PCR檢測了GzLysG基因在扎那紋胸鮡不同組織中的表達情況。結果如圖6所示,GzLysG基因在多個組織中均有表達,其在不同待檢組織中的表達量差異性較大。GzLysG基因在皮膚中的表達量最高,表達量約為在腸中表達量的633倍;在肌肉和鰓中的表達量次之,分別為在腸中表達量的476和81倍;其在肝臟、脾臟和腸中的表達量較低。

圖6 GzLysG mRNA在扎那紋胸鮡不同組織中的相對表達量

3 討論

近年來,隨著水產養殖生態環境的惡化,魚類病害發生率居高不下。水產養殖對于抗生素的過度依賴已在全球范圍內造成了嚴重的微生物耐藥性問題。因此,提高魚類自身免疫防御能力,研發安全高效的抗生素替代品,是魚類疾病防控的未來研究方向[8]。相較于特異性免疫,非特異性免疫系統在魚類抵抗病原菌時發揮更為重要的作用[10]。作為宿主重要的非特異性免疫因子,魚類溶菌酶因具有廣譜、高效、生物安全的抗菌活性在防治水生動物病害方面展現出良好的應用前景[2,10]。本研究通過基因克隆和生物信息學方法獲得一條扎那紋胸鮡溶菌酶GzLysG的編碼序列。GzLysG具有g型溶菌酶典型的結構特征,含有3個保守的活性催化位點、GEWL結構域和SLT結構域。研究[2]發現,二硫鍵的存在有助于維持溶菌酶的結構穩定性,而g型溶菌酶中二硫鍵數目會因物種不同存在很大的變化。鳥類和哺乳動物g型溶菌酶均含有4個保守的半胱氨酸,可形成2個穩定的二硫鍵。魚類中,大西洋鮭魚中g型溶菌酶有3個半胱氨酸[11],大菱鲆和日本鰻鱺中g型溶菌酶有2個半胱氨酸,但不能形成二硫鍵[12],而鯉魚、牙鲆、條石鯛等多數魚類中g型溶菌酶均無半胱氨酸。本研究中,GzLysG序列中僅存在1個半胱氨酸殘基。二硫鍵的缺失將會影響g型溶菌酶的結構特性,在溫度變化時其活性也會改變,推測魚類g型溶菌酶還存在其他維持結構穩定的機制。

除了抗菌活性,一些溶菌酶還被報道具有免疫調節、抗腫瘤、消化等功能[13-14]。GzLysG是一種偏堿性的親水性蛋白,無信號肽,編碼該蛋白的氨基酸中以賴氨酸含量最高,說明GzLysG主要為胞內起抗菌活性的溶菌酶。值得注意的是,GzLysG雖與斑馬魚DRLysG、日本鰻鱺AJLysG2具有較高的同源性,但與二者的組織表達模式差異明顯。DRLysG和AJLysG2被報道在鰓和免疫器官如肝臟、脾臟中具有較高的表達量[12]。而GzLysG基因雖在腸、肝臟、脾臟這些免疫器官中均有被檢測到,但其在皮膚和肌肉組織中表達量最高,鰓中次之。魚類的皮膚、鰓和肌肉等是阻擋病原菌入侵的重要機械屏障,也是參與其免疫應答反應的重要組織器官。GzLysG基因在這些免疫相關組織中的高表達,提示了該溶菌酶在扎那紋胸鮡固有免疫防御中發揮著重要作用。

通過轉基因技術轉入溶菌酶基因,可獲得抗病能力強的轉基因魚[8]。將溶菌酶作為飼料添加劑應用于水產養殖,可提高鰻魚、草魚等的生長性能和抗感染能力。將溶菌酶與凝結芽孢桿菌、丁酸梭菌等益生菌,與寡糖、中草藥、植物精油、抗菌肽等功能性飼料添加劑共同使用,均具有良好的協同增效效果,是優秀的抗生素替代組合方案。本文克隆了GzLysG的cDNA序列,并對其分子結構特征、組織表達譜等進行了分析,初步探討了GzLysG在扎那紋胸鮡先天免疫防御中的作用。該研究有助于扎那紋胸鮡的人工科學養殖,未來課題組將進一步圍繞GzLysG的功能和作用機制開展研究。