血清外泌體miR-30d-5p靶向RHOB在三氯乙烯藥疹樣皮炎中的作用

蔡曙陽,王 慧,張雪松,左緒磊,馬金茹,洪依婷,吳奇峰,朱啟星,

三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)是一種工業(yè)上常用的有機(jī)溶劑,在TCE接觸的職業(yè)工人中,少部分可出現(xiàn)類似于藥疹樣皮炎的皮膚大面積表皮壞死和剝脫,臨床上稱為三氯乙烯藥疹樣皮炎(occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,OMDT)[1]。除了皮膚損傷外,部分OMDT患者還伴有嚴(yán)重的肝功能異常,因此,開展TCE引起的肝臟損傷及其機(jī)制研究,具有重大的職業(yè)衛(wèi)生意義。

目前,OMDT通常被認(rèn)為是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)為主的復(fù)合免疫反應(yīng)[2],早些研究發(fā)現(xiàn)多種免疫細(xì)胞可以分泌外泌體,如巨噬細(xì)胞[3]、樹突狀細(xì)胞[4]和NK細(xì)胞[5],這些外泌體廣泛存在于血液、尿液和唾液等體液中[6],參與免疫細(xì)胞間的通信作用。外泌體中miR-30d-5p被發(fā)現(xiàn)參與多種免疫反應(yīng),如非分型流感嗜血桿菌引起的急性中耳炎[7]、布氏弧桿菌引起的胃腸炎[8]等 ,但是在TCE引起的免疫性肝臟損傷中miR-30d-5p是否發(fā)揮作用還尚不明確。因此,該研究旨在探索OMDT患者肝臟損傷機(jī)制中miR-30d-5p的作用及可能參與的生物信息學(xué)過程。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2020年廣東省職業(yè)病防治院收治的OMDT患者6例,所有病例均按照 GBZ 185—2006《職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行診斷[9]。納入標(biāo)準(zhǔn):① 有明確的TCE接觸史;② 出現(xiàn)以皮疹、發(fā)熱、肝功能損害和淺表淋巴結(jié)腫大等臨床表現(xiàn);③ 既往身體健康,無藥物、食物過敏史。排除標(biāo)準(zhǔn):① 有激素用藥史或肝毒性藥物使用史;② 有肝病家族史;③ 發(fā)病前接觸其他明確的職業(yè)危害因素。另在安徽醫(yī)科大學(xué)校醫(yī)院收集肝功能正常的健康志愿者6例,與患者按照年齡(±3歲)和性別1 ∶1匹配。患者肝功能指標(biāo)結(jié)果由住院病歷中的檢測報告單獲得。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:5101302),所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑血清外泌體提取試劑盒、miRNA提取試劑盒(德國Qiagen公司);miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];Mix溶液(瑞士Roche公司);HSP-70抗體、Flotillin-1抗體、CD9抗體(英國Abcam公司);RIPA裂解緩沖液、PMSF蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);PVDF膜、Western blot發(fā)光液試劑盒(德國GE Healthcare公司);miR-30d-5p mimics、miR-NC mimics、野生和突變RHOB質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);HEK-293T細(xì)胞由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院贈予;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素(美國Gibico公司)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR儀(瑞士Roche公司,Light Cycler 96);納米顆粒跟蹤分析儀(德國Particle Metrix公司,PMX-120);透射電子顯微鏡(美國Thermo Scientific公司,Ta1os L120C G2);Western blot全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司,Chemiscope 6000 Touch);微孔板發(fā)光檢測儀 (美國Promega公司,GloMax96)。

1.3 血清收集與外泌體提取用含有促凝劑的采血管收集新鮮全血,室溫靜置5 min后以3 000 r/min離心15 min,將上層血清分裝置于-80 ℃冰箱保存。取2 ml血清樣本,按照血清外泌體提取試劑盒說明書進(jìn)行操作,首先將溶解后的血清用0.22 μm過濾器過濾,與緩沖液XBP等體積混合,2 000 r/min離心1 min,之后加入3.5 ml的緩沖液XWP,12 000 r/min離心5 min,最后加入400 μl的緩沖液XE,2 000 r/min離心5 min,用PBS溶液重懸收集外泌體。

1.4 外泌體鑒定

1.4.1透射電子顯微鏡觀察 將收集的外泌體用200 μl的PBS溶液重懸后滴至潔凈封口膜上,然后用鑷子夾取一枚載網(wǎng)置于外泌體液滴上,懸浮10 min,用濾紙緩慢吸干;后轉(zhuǎn)移載網(wǎng)到2.5%戊二醛液滴上,懸浮5 min,用濾紙吸干;最后將載網(wǎng)轉(zhuǎn)移到去離子水液滴上漂洗10次,每次2 min,漂洗完畢后用濾紙吸干,轉(zhuǎn)移載網(wǎng)到40 g/L乙酸雙氧鈾液滴上染色10 min,濾紙吸干后轉(zhuǎn)移載網(wǎng)到10 g/L甲基纖維素液滴上染色5 min,濾紙吸干液體后室溫靜置干燥10 min,放入樣品架電鏡下觀察記錄。

1.4.2納米顆粒跟蹤分析 首先用去離子水清洗機(jī)器樣本池,然后以聚苯乙烯微球(100 nm)標(biāo)準(zhǔn)品對機(jī)器進(jìn)行校準(zhǔn),再使用1×PBS溶液清洗機(jī)器樣本池。準(zhǔn)備工作完成后將外泌體樣本用PBS溶液稀釋至1×106/ml,用注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀,每個樣本重復(fù)測量3次,軟件會對樣本里顆粒的運動特征進(jìn)行記錄,同時加以分析后會得到粒徑-濃度分布圖數(shù)據(jù),可以檢測外泌體樣品的粒徑大小。

1.4.3Western blot法檢測外泌體標(biāo)志蛋白 提取外泌體樣品蛋白并定量,然后使用SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離,200 mA轉(zhuǎn)膜3 h,將PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。之后將膜與HSP-70(1 ∶1 000)、Flotillin-1(1 ∶1 000)、CD9(1 ∶1 000)抗體一起置于4 ℃孵育過夜。第2天,將膜在含有0.05% Tween-20的TBST中洗滌3次,每次10 min,然后與山羊抗兔IgG抗體或山羊抗鼠IgG抗體(1 ∶5 000)一起室溫孵育2 h。將膜在含有0.05% Tween-20的TBST中洗滌3次,每次10 min,用ECL檢測試劑盒進(jìn)行顯影。

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件的統(tǒng)計程序進(jìn)行T檢驗分析，統(tǒng)計結(jié)果P＜0.01表示組間差異極顯著，P＜0.05表示組間差異顯著，0.05≤P＜0.10表示組間差異趨于顯著。

1.5 外泌體RNA提取與qRT-PCR檢測使用外泌體RNA純化試劑盒提取血清外泌體中包含miRNA的總RNA,采用加尾法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min后以95 ℃ 15 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環(huán)45次。所得結(jié)果使用比較循環(huán)閾值(2-ΔΔCt)法分析,以miR-16作為內(nèi)參基因,計算miR-30d-5p的相對表達(dá)量,每個樣本重復(fù)檢測3次。引物序列:miR-16(F):GC-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG;miR-30d-5p(F):TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG;通用引物(R):CGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C將HEK-293T細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。使用購買的RHOB質(zhì)粒與miR-30d-5p(miR-NC)模擬物進(jìn)行實驗。取對數(shù)生長期的HEK-293T細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于6孔板上,根據(jù)說明書進(jìn)行操作,分別將配套的轉(zhuǎn)染試劑與miR-NC模擬物、miR-30d-5p模擬物、野生型RHOB質(zhì)粒、突變型RHOB質(zhì)粒等共同加入細(xì)胞,隨機(jī)分為4組:野生型+miR-30d-5p組(共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒和miR-30d-5p模擬物)、野生型+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒和miR-NC模擬物)、突變型+miR-30d-5p組(共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒和miR-30d-5p模擬物)、突變型+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒和miR-NC模擬物),6 h后棄去換成新的培養(yǎng)基,再過12 h左右完成轉(zhuǎn)染過程,此時檢測各組中螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。

1.7 生物信息學(xué)分析采用功能聚類(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫對基因產(chǎn)物的屬性進(jìn)行分析,它包含三大類:生物學(xué)過程(biological process,BP);細(xì)胞組分(cellular component,CC);分子功能(molecular function,MF)。在Gene Ontology中輸入miR-30d-5p,并選擇物種為人類,檢索后得到富集結(jié)果。途徑富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)是分析基因功能、聯(lián)系基因組信息和功能信息的數(shù)據(jù)庫。在本研究中,使用KEGG數(shù)據(jù)庫中的代謝通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索分析,探索miR-30d-5p的靶基因可能與哪些通路相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本情況12例研究對象均無激素用藥史或肝毒性藥物使用史,無肝病家族史,6例OMDT患者中男性4例(66.7%),女性2例(33.3%),均有明確的TCE接觸史,與6例健康志愿者按性別和年齡與患者1 ∶1進(jìn)行配對。以M(P25,P75)計,可知:OMDT患者年齡為20.0(17.5～23.8)歲;健康志愿者年齡為23(19.8～24.5)歲,經(jīng)秩和檢驗兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.194,P>0.05)。

2.2 血清外泌體的鑒定電鏡觀察外泌體呈圓形、橢圓形,具有雙層脂質(zhì)包膜結(jié)構(gòu),Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)外泌體特征性膜蛋白CD9、Flotollin-1和HSP70表達(dá)陽性,納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體粒徑約200 nm,均符合外泌體的特征,見圖1。

圖1 血清外泌體鑒定

2.3 血清外泌體中miR-30d-5p基因表達(dá)水平的改變qRT-PCR結(jié)果顯示,對照組、發(fā)病高峰期組和發(fā)病恢復(fù)期組血清外泌體中miR-30d-5p相對表達(dá)水平分別為:0.90(0.58,2.12),0.14(0.01,0.55),0.93(0.73,1.29)。發(fā)病高峰期組血清外泌體中miR-30d-5p表達(dá)水平明顯低于其他兩組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=6.398,P=0.034),見圖2。

圖2 患者各組血清外泌體miR-30d-5p表達(dá)水平

2.4 OMDT患者治療前后肝功能指標(biāo)水平的改變肝功能檢查結(jié)果顯示,6例患者入院時發(fā)病高峰期天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST) 、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT) 、γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl transferase,GGT)明顯升高,與出院時發(fā)病恢復(fù)期比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.201,P=0.028;Z=-2.201,P=0.028;Z=-2.201,P=0.028),見圖3。

圖3 OMDT患者肝功能指標(biāo)水平

表1 OMDT患者血清外泌體miR-30d-5p表達(dá)水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.6 OMDT患者血清miR-30d-5p表達(dá)水平的生物信息學(xué)分析在miRWalk數(shù)據(jù)庫中篩選出了535個miR-30d-5p的候選靶基因,在miRBD數(shù)據(jù)庫中篩選出了736個miR-30d-5p的候選靶基因,兩個數(shù)據(jù)庫的交集顯示了46個候選靶基因,采用GO分析和KEGG分析對這些候選靶基因結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步研究。GO分析從生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三個方面對結(jié)果進(jìn)行描述,發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p主要參與鈣調(diào)素結(jié)合與鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶的激活等73個分子功能,異三聚體G蛋白與轉(zhuǎn)運囊泡膜等81個細(xì)胞組分以及血管形態(tài)學(xué)重構(gòu)與肽基絲氨酸磷酸化等172個生物學(xué)過程,圖4中展示的是相關(guān)性較為密切的前10個結(jié)果。KEGG分析表明大多數(shù)候選靶基因在膽堿能突觸、破骨細(xì)胞分化、Apelin信號通路、Wnt信號通路和Oxytocin信號通路等途徑中富集,圖4中展示的是相關(guān)性較為密切顯著的前30個條目。上述結(jié)果說明miR-30d-5p廣泛參與機(jī)體免疫反應(yīng)的生理病理學(xué)過程。

圖4 功能聚類分析和生物通路分析

2.7 miR-30d-5p靶向調(diào)控RHOB基因為進(jìn)一步明確miR-30-5p發(fā)揮生物學(xué)功能的可能機(jī)制,在上述生信分析結(jié)果中選取RHOB基因進(jìn)行下一步研究。利用psiCHECK2質(zhì)粒作為骨架,將預(yù)測的miR-30d-5p與RHOB結(jié)合部位序列及其突變體序列剪切并插入到螢火蟲熒光素酶基因下游,分別構(gòu)建野生和突變的RHOB表達(dá)載體,與miR-30d-5p模擬物或miR-NC模擬物同時轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測實驗。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-30d-5p模擬物可顯著下調(diào)帶有RHOB野生3′-UTR序列的報告基因熒光素酶活性,而靶基因序列突變后的熒光素酶活性不受影響,轉(zhuǎn)染miR-NC模擬物后不影響野生和突變組的報告基因熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.458,P=0.003),見圖5。以上結(jié)果證明miR-30d-5p模擬物可特異性靶向結(jié)合RHOB的3′-UTR序列,從而調(diào)控RHOB的表達(dá)水平。預(yù)測結(jié)合位點序列:RHOB 3′UTR:...AUGGUGAGCUUAUGAUGUUUACA...;miR-30d-5p 3′UTR:GAAGGUCAGCCCCUACAAAUGU。

圖5 雙熒光素酶報告基因

3 討論

職業(yè)人群暴露TCE主要通過呼吸道和皮膚進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮毒性作用,影響多種臟器,其中以肝臟最為多見,可繼發(fā)肝炎等多種疾病,嚴(yán)重影響患者預(yù)后。本研究6例患者在發(fā)病高峰期肝功能指標(biāo)異常升高,存在明顯的肝臟損傷。目前OMDT的肝損傷發(fā)病機(jī)制并未完全闡明,有待進(jìn)一步研究。

一項研究[10]顯示TCE暴露工人的外周血血清miR-150-5p等miRNA分子表達(dá)水平有明顯改變,另一項研究[11]顯示血清外泌體miR-21-5p和miR-339-5p表達(dá)水平與職業(yè)性三氯乙烯超敏反應(yīng)綜合征相關(guān),外泌體miR-21和miR-690也被發(fā)現(xiàn)加重了TCE介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)[12]。因此,血清外泌體包裹的miRNA作為一種穩(wěn)定的功能分子,無論是作為臨床治療的靶點,還是作為早期預(yù)測或診斷的生物標(biāo)志物,在OMDT的臨床研究中都具有廣闊的前景。先前的研究[13]表明,miR-30d-5p可以通過參與T細(xì)胞與B細(xì)胞的激活調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng),并且與非酒精性脂肪性肝等多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),結(jié)合一項關(guān)于TCE暴露人群miRNA的芯片研究[14],其中miR-30家族有明顯差異表達(dá),因此本研究選擇了miR-30d-5p進(jìn)行深入探討。

本研究收集了OMDT患者的血清后提取外泌體,并對其進(jìn)行鑒定。目前普遍認(rèn)為外泌體的直徑在30～150 nm之間,微囊泡的直徑一般在100～1 000 nm之間,本研究結(jié)果中顯示其直徑約為200 nm,屬于粒徑偏小的一部分,參考相關(guān)文獻(xiàn)后依然選擇外泌體對其進(jìn)行描述[15]。電鏡結(jié)果顯示其呈圓形、橢圓形,具有雙層脂質(zhì)包膜結(jié)構(gòu),Western blot結(jié)果顯示其表面的特殊蛋白CD9、Flotollin-1和HSP70表達(dá)呈陽性,與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[16],為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。qRT-PCR結(jié)果顯示,OMDT患者發(fā)病高峰期時血清外泌體的miR-30d-5p水平明顯降低,并且與AST、ALT和GGT指標(biāo)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),推測血清外泌體miR-30d-5p可能參與了OMDT患者的肝臟損傷的過程。

對miR-30d-5p進(jìn)行靶基因的預(yù)測及生物學(xué)信息分析結(jié)果顯示,miRWalk及miRBD數(shù)據(jù)庫共預(yù)測到46個miR-30d-5p的可能靶點,其中RHOB是一種小的GTP酶,屬于GTPase信號分子家族,是細(xì)胞分裂、膜泡運輸、傷口愈合或免疫監(jiān)視等多種細(xì)胞和生理過程中的關(guān)鍵介質(zhì),同時還被發(fā)現(xiàn)參與非酒精性脂肪肝病、肝纖維化等多種肝臟損傷[17],這與GO分析結(jié)果高度相似。KEGG結(jié)果顯示了RHOB可能參與的信號通路,其中包括cAMP、Wnt、calcium在內(nèi)的大多數(shù)都與免疫性肝病密切相關(guān)。miR-30d-5p與RHOB的靶向關(guān)系在多個網(wǎng)站被預(yù)測到(http://www.targetscan.org、http://genome.ucsc.edu),雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,miR-30d-5p模擬物可特異性靶向結(jié)合RHOB的3′-UTR序列,說明miR-30d-5p可以負(fù)向調(diào)控RHOB的表達(dá),本研究雖然未能檢測OMDT患者肝臟的RHOB表達(dá)水平,但是在課題組正在進(jìn)行的TCE致敏小鼠模型研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)致敏陽性鼠的肝臟組織中RHOB基因表達(dá)水平明顯升高,提示RHOB有望成為OMDT的治療靶點之一。

綜上所述,OMDT患者血清外泌體miR-30d-5p表達(dá)水平降低,與肝臟損傷程度呈負(fù)相關(guān),并且本研究確定了miR-30d-5p與RHOB基因的靶向調(diào)控關(guān)系,為深入研究OMDT患者肝損傷的具體調(diào)控機(jī)制提供了指導(dǎo)方向,但本研究實驗中并未對miR-30d-5p的表達(dá)進(jìn)行干預(yù),因此還需要進(jìn)一步研究以獲得確定性的結(jié)論。