Sigirr缺失調控NF-κB并參與慢性腎病小鼠發生腎間質纖維化

童子文,徐德蘋,王 喆,楊 萍,涂珍珍,臧丹丹,周海勝,

單一免疫球蛋白白細胞介素-1受體相關受體(single immunoglobulin interleukin-1 related receptor,SIGIRR)介導的信號通路具有抑制白細胞介素(interleukin,IL)-1的活性。前期研究[1]發現NF-κB/SIGIRR負調控IL-1β誘導的腎小管上皮-成纖維細胞轉分化。研究[2-4]證實在IL-1的刺激下, SIGIRR以配體依賴性方式與IL-1受體復合物相互作用。腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis ,RIF) 是慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)發展過程中常見的病理改變[5],其發病機制是與炎癥因子、細胞因子和轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1 等活化相關信號通路有關[6-7]。目前研究CKD并發RIF的模型主要是通過單側輸尿管的結扎術誘發的急性腎損傷的大鼠模型[8]。但其與臨床上常見的慢性腎病并發RIF的過程具有較大差異性。為探討SIGIRR在CKD并發RIF中的作用,該研究擬使用Sigirr基因敲除小鼠(Sigirr-/-)在高嘌呤飲食誘發腎臟慢性損傷,建立CKD并發RIF小鼠模型,觀察RIF的病理特點及SIGIRR在RIF發生過程中作用和機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑野生型C57BL/6(Sigirr+/+)小鼠、Sigirr-/-小鼠購自南京集萃藥康股份有限公司,飼養于 SPF 級的動物房,飼養條件為恒溫(22±2)℃,濕度60%,明暗周期為12 h/12 h,小鼠體質量(22±2)g。所有動物實驗均遵循《實驗動物護理和使用指南》和安徽醫科大學倫理指南(倫理號:LISC20200007)。鼠源E-cadherin抗體、兔源Vimentin抗體、兔源 α-SMA 抗體、兔源P65抗體、兔源p-P65抗體、 抗鼠或兔抗體購買于美國 Cell Signaling Technology 公司。鼠源 IL-1β 抗體、兔源TGF-β1抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。鼠源 p-p65 抗體購自上海圣克魯茲生物技術有限公司。瓊脂凝膠糖粉購自于北京擎科生物科技有限公司。免疫組織化學試劑盒、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。改良 Masson 三色染色液購自北京索萊寶科技有限公司。正常小鼠飼料和含有0.2%腺嘌呤的高腺嘌呤飼料均購自于無錫戴茨生物科技有限公司。PCR試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。用于PCR檢測小鼠基因組DNA的Sigirr敲除引物: P1:5′-TTCCAGTAGTCGGTTCTGA-ACTCAG-3′,P2:5′-TGTGGAGGTCAAACCTCTTAGG-3′,PCR擴增產物為900 bp;用于PCR檢測野生型Sigirr的引物:P3:5′-AGCCTAAATCTGCAATCTCTCCC-3′,P4:5′-GAAACCTGTGCCCTAATCCATG-3′,PCR擴增產物為496 bp;引物均是由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 CKD并發RIF小鼠模型的建立取7～8周齡的Sigirr+/+小鼠和Sigirr-/-小鼠各8只, 均為雄性小鼠。將小鼠隨機進行分組,包括高腺嘌呤喂養組:即高腺嘌呤飼料喂養12周(4只Sigirr+/+、4只Sigirr-/-鼠);正常飼料喂養的對照組:正常飼料喂養12周(4只Sigirr+/+、4只Sigirr-/-鼠)。12周后,異氟烷麻醉小鼠,眼眶靜脈叢采血用于后續生化分析,處死,取兩腎臟分別固定于4%多聚甲醛和放在-80 ℃冰箱中,備用。

1.3 各組小鼠腎組織病理學檢查小鼠腎組織常規脫水包埋、切片,烤片、脫蠟至水。進行HE 染色和Masson染色,中性樹脂封片,鏡下觀察拍照。

1.4 免疫組織化學分析(immunohistochemistry analysis,IHC)切片脫蠟至水,利用檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復, 3%過氧化氫溶液覆蓋組織阻斷過氧化物酶,4 ℃孵育一抗過夜,孵育增強劑,孵育二抗,DAB顯色,蘇木精核染,鹽酸酒精分化,脫水封片,拍照分析。

1.5 Western blot實驗取凍存小鼠腎組織每組50 mg,裂解液提取總蛋白,配置10% SDS-PAGE膠,每孔蛋白上樣6 μl,電泳分離、轉膜,然后5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h,4 ℃孵育一抗過夜,洗膜。對應二抗室溫孵育2 h,洗膜、蛋白條帶加ECL曝光顯色。用凝膠圖像處理系統(Image J 軟件)得出灰度值。

1.6 小鼠基因型的PCR鑒定剪去一段小鼠鼠尾,常規提取鼠尾的基因組DNA作為模板。擴增結束,對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結果

2.1Sigirr-/-小鼠基因型鑒定提取Sigirr-/-小鼠和Sigirr+/+小鼠鼠尾基因組,分別利用敲除引物和WT引物進行PCR擴增。結果顯示Sigirr-/-小鼠基因組在P1-P2引物擴增后900 bp特異條帶,但P3-P4引物擴增顯示陰性結果;Sigirr+/+小鼠基因組在引物擴增獲得496 bp的特異性條帶,而P1-P2引物擴增未出現條帶(圖1)。因此,擬建立模型的小鼠為C57BL/6品系Sigirr-/-和Sigirr+/+純合小鼠。

圖1 PCR鑒定小鼠鼠尾基因組DNA的Sigirr基因

2.2 CKD并發RIF小鼠模型的建立及相關指標比較按照圖2A的方案,采用高腺嘌呤飼料和正常飼料喂養Sigirr-/-小鼠和Sigirr+/+小鼠,持續時間為12周。觀察發現:高腺嘌呤飼料喂養小鼠的腎臟顏色顯示黃白色,硬度較對照組明顯增加;且腎臟內含大量積液,液體呈黃褐色渾濁樣,并有明顯的腎腫脹伴有顆粒狀和腎盂積水現象,對照組小鼠腎臟肉眼未見異常(圖2B)。

圖2 CKD并發RIF小鼠模型建立

腎功能檢測結果顯示兩組小鼠血清尿素氮和肌酐比較差異有統計學意義(F=92.10,P<0.001;F=16.5,P<0.001)。與高嘌呤喂養Sigirr+/+組小鼠比較,高嘌呤喂養組Sigirr-/-小鼠血清尿素氮水平升高,差異有統計學意義(均P<0.01)。與正常飼料喂養組Sigirr+/+小鼠和Sigirr-/-小鼠比較,高嘌呤喂養組Sigirr+/+小鼠和Sigirr-/-小鼠的血清尿素氮(均P<0.001)和肌酐(P<0.05,P<0.01)水平升高,差異有統計學意義(圖2C、D)。

HE染色顯示對照組的小鼠腎組織形態及結構正常,在高嘌呤喂養組小鼠腎臟中觀察到腎小管擴張和大量炎性細胞浸潤且出現腎小球硬化等形式的腎損傷,且Sigirr-/-小鼠腎臟組織中,炎性細胞浸潤、小球充血等病理變化較對照組更明顯(圖2E)。

Masson染色結果顯示:高腺嘌呤飼料喂養組出現藍色沉積;與對照組腎臟組織比較,高腺嘌呤喂養組小鼠腎臟中膠原沉積顯著增加,且Sigirr-/-小鼠腎組織的膠原沉積較Sigirr+/+小鼠更嚴重(圖2E)。

2.3Sigirr基因缺失對IL-1β活化MyD88/NF-κB信號通路的影響利用IHC檢測模型小鼠腎臟組織中IL-1β的表達水平。結果顯示:CKD-RIF模型小鼠腎臟組織中,IL-1β表達水平較對照組腎臟組織顯著增加;且Sigirr基因缺失時,IL-1β的增加更明顯(圖3A)。進一步利用IHC檢測其下游信號分子MyD88和磷酸化P65(p-P65)的變化。結果發現,伴隨CKD-RIF小鼠的腎組織中的IL-1β表達升高,與對照組比較,MyD88、p-P65的均明顯增加;特別是與 CKD-RIF模型的Sigirr+/+小鼠的腎組織比較,CKD-RIF的Sigirr-/-小鼠腎組織增加較更明顯。同時用新鮮腎組織,提取總蛋白進行Western blot分析,結果顯示(圖3B、C):Sigirr-/-和Sigirr+/+的CKD-RIF小鼠的腎組織比對應的非模型組小鼠腎組織中IL-1β表達水平均明顯增加,且Sigirr-缺失的CKD-RIF小鼠較Sigirr+/+組顯著增加(P<0.001);MyD88、p-P65變化與IHC的結果一致,且差異均有統計學意義 (P<0.001)。

圖3 IHC、Western blot檢測模型小鼠的腎組織IL-1β、MyD88、p-P65變化

2.4 TGF-β1介導的腎間質上皮-肌成纖維細胞轉化(epithelial-myofibroblast transition,EMT)促進CKD-RIF的發生利用IHC檢測各組模型小鼠的腎組織中的TGF-β1、E-cadherin、Vimentin等表達水平。結果顯示:與對照組的小鼠腎臟組織比較,發生RIF小鼠的腎組織中的TGF-β1表達水平明顯升高(圖4A); RIF小鼠腎組織中,E-cadherin表達降低同時Vimentin增加,且Sigirr-/-小鼠腎臟中E-cadherin的減少和Vimentin的增加比Sigirr+/+小鼠更為明顯(圖4B)。同時利用分離獲取的新鮮腎組織,提取總蛋白進行免疫印跡分析,結果顯示(圖4C):Sigirr-/-和Sigirr+/+的CKD-RIF小鼠的腎組織比對應的非模型組小鼠腎組織中α-SMA表達水平均明顯增加,且Sigirr-/-的CKD-RIF小鼠較Sigirr+/+的CKD-RIF小鼠顯著增加(P<0.01,P<0.001);E-cadherin、Vimentin變化與IHC的結果一致,且差異均有統計學意義(P<0.001)。

3 討論

炎癥反應可以誘發CKD發生RIF。CKD并發RIF在病理上表現為EMT且伴隨腎間質炎癥細胞浸潤[9]。目前在研究RIF的模型大多數是采用單側輸尿管結扎的大鼠模型,與臨床上RIF的病因和發病機制方面存在較大差異。采用腺嘌呤飼料喂養小鼠引起腎臟慢性損傷在探討CKD-RIF機制具有一定的優勢。本研究使用0.2%腺嘌呤飼料喂養小鼠12周后,發現腎臟顯示為黃白色,且腎組織內含大量黃褐色渾濁樣積液,有明顯的腎腫脹伴有顆粒狀和腎盂積水現象。其原因可能是小鼠體內形成了溶解度較低的2,8-二羥基嘌呤,導致腎損傷腎積水[10]。更重要的是腎功能檢測高嘌呤喂養組小鼠血清尿素氮和肌酐高于對照組小鼠。HE染色顯示高嘌呤飲食組小鼠腎臟組織粒細胞進入腎小管管腔、腎小管萎縮且出現腎小球硬化。因此,利用腺嘌呤飼料喂養小鼠成功建立了慢性腎臟損傷的小鼠模型。

持續慢性腎臟損傷容易誘發RIF,主要病理變化是細胞外基質聚集在腎間質和腎小管周圍,導致腎臟的纖維化和硬化[8]。本研究Masson染色的結果顯示:腎間質中出現大量藍色條索狀沉淀,提示CKD并發RIF造模成功。在對腎臟組織進行IHC和Western blot分析,顯示上皮細胞的標記分子E-cadherin表達顯著降低,而成纖維細胞標記分子Vimentin和肌成纖維標記分子α-SMA表達增加。證實腺嘌呤誘發慢性腎臟損傷導致RIF與EMT的發生有關。

IL-1β是一種常見的促炎癥、促纖維化的細胞因子,在CKD及其并發的RIF過程中發揮重要作用。IL-1β通過結合IL-1受體,依賴MyD88進而激活NF-κB信號通路,增加TGF-β1 的表達[2,8,11]。TGF-β1是EMT的重要誘導分子,促進RIF的發生和發展。通過檢測腎臟組織中 IL-1β 、MyD88、p-P65和 TGF-β1,結果發現高嘌呤喂養組小鼠腎臟組織,IL-1β 、MyD88和 TGF-β1等分子均顯示較高表達水平,而且與P65的活化狀態保持一致性。因此腺嘌呤飲食誘發CKD-RIF的機制是依賴于IL-1β激活NF-κB/TGF-β1信號通路,促進RIF。

SIGIRR作為IL-1β的負性調控分子,能與IL-1受體和其他信號分子如MyD88相互作用,從而抑制IL-1β/IL-1受體介導NF-κB信號通路的活化[12-13]。為進行體內研究SIGIRR在CKD-RIF發生中作用,利用Sigirr基因敲除小鼠,通過喂養腺嘌呤飼料建立CKD-RIF模型。與Sigirr+/+的模型小鼠比較,腎功能、腎臟的大體形態、組織結構、Masson染色等表型變化,Sigirr-/-腎臟損傷更為嚴重,纖維化程度更明顯;同時IHC和Western blot分析證實:CKD-RIF的Sigirr-/-小鼠腎臟組織中Vimentin、α-SMA表達均較Sigirr+/+腎組織顯著增加,E-cadherin的表達顯著減少。因此,Sigirr缺失加劇腎臟慢性損傷,促進RIF。蛋白質水平檢測結果發現:CKD-RIF的Sigirr-/-小鼠腎臟組織中 IL-1β 、MyD88、p-P65比CKD-RIF的Sigirr+/+的模型小鼠腎臟組織明顯增加。因此,Sigirr基因缺失加劇RIF的發生發展,這是與增強IL-1β/NF-κB/TGF-β1信號通路的活性有關。

綜上所述,利用高腺嘌呤飼料較長時間喂養小鼠,可以建立CKD并發RIF的小鼠模型,在此模型中,主要是通過IL-1β活化NF-κB/TGF-β1信號通路,使腎間質發生EMT;SIGIRR作為IL-1β的負性調控分子,Sigirr基因的缺失有利于活化IL-1β/NF-κB/TGF-β1信號通路,促進RIF的發生發展。