克立硼羅軟膏調節角質形成細胞異常活化緩解小鼠銀屑病作用

桂雨晴,唐彩紅,陳鏡宇,姜 玲,2,魏 偉

克立硼羅(crisaborole,Cri)是磷酸二酯酶4(phosphodiesterases 4,PDE4)抑制劑,通過抑制PDE4活性,增加細胞內環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的含量,發揮抗炎免疫作用。Cri軟膏能顯著減輕特應性皮炎的瘙癢反應,用于治療3個月以上兒童和成人的輕度或中度特應性皮炎[1],也有報道[2]Cri對銀屑病有效,但機制不清楚。銀屑病是一種慢性炎癥增殖性皮膚病變,角質形成細胞的異常增殖分化是其重要特點。角質形成細胞的異常分化引起銀屑病斑塊脫落,同時參與皮損區T細胞活化,起著放大皮損區免疫異常作用[3]。體外研究[4]表明Cri體外可以降低人表皮角質形成細胞促炎介質腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1α 和趨化因子8的表達,提示角質形成細胞可能是Cri的靶細胞,而Cri軟膏是否通過調節角質形成細胞功能發揮對銀屑病的治療作用仍不清楚。該研究利用銀屑病小鼠模型,從角質形成細胞的角度探討Cri治療銀屑病的作用機制,為開發Cri新的適應證提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Balb/c小鼠,48只,雌性,7～8周齡,購于北京斯貝福生物科技有限公司[生產許可證:SCXK(京)2019-0010],飼養在安徽醫科大學臨床藥理研究所的SPF動物研究室。所進行的動物實驗,都經過安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理委員會認可(動物倫理批號:PZ-2022-001)。本實驗中所涉及的技術,都遵循動物實驗的有關準則和規范。

1.2 藥物與試劑角蛋白(keratin,K)1一抗、K10一抗(美國Proteintech公司,批號:00045116、14t1484);K6一抗、K16一抗、GAPDH一抗(英國Affinity公司,批號:00059940、39d4400、62u0922);K17一抗、磷酸化-cAMP反應元件結合蛋白(phospho-cAMP response element binding protein,p-CREB)一抗(美國Cell Signaling公司,批號:4543T、9189S);ECL化學發光試劑(美國賽默飛公司,批號:TG269475);EDTA 抗原修復液(pH 9.0)、免疫組化通用型試劑盒(北京中杉金橋公司,批號:19042401、2010D1217);咪喹莫特(imiquimod,IMQ)乳膏(四川明欣藥業有限責任公司,批號:19070240);Cri軟膏(美國輝瑞公司,批號:8119272);鹵米松(香港澳美制藥公司,批號:0101390227);凡士林乳膏(天津市博迪化工有限公司,批號:11021);脫毛膏(植物醫生溫和套裝,北京明弘科貿有限責任公司,批號:ACG0800604)。

1.3 儀器酶標儀(型號:Infinite M1000 PRO,瑞士TECAN公司);正置熒光顯微鏡(型號:DM2500,德國Leica公司);化學發光成像系統(型號:ImageQuant,美國GE公司)。

1.4 動物分組與銀屑病模型的建立將48只Balb/c小鼠隨機分成模型組、正常組、Cri(7.5、15、30 mg/cm2)組(Cri低、中、高劑量組)、鹵米松(15 mg/cm2)組,每組8只,造模前3 d每只背部脫毛(2 cm × 3 cm)2 min,為防止背部毛發再生影響后續造模及評分,造模前1 d進行第2次背部脫毛。造模后第1～3天,正常組涂抹凡士林以外,其余各組背部皮膚涂抹62.5 mg IMQ(5%)乳膏每天1次,第4天開始各給藥組先涂抹62.5 mg IMQ(5%)乳膏1次,待其吸收后,Cri組涂抹相應的Cri劑量(45、90、180 mg)1次,鹵米松組涂抹鹵米松(90 mg)1次,連續涂抹藥物4 d,第8天處死小鼠。

1.5 小鼠背部皮膚觀察造模后第1、3、5、7天對小鼠拍照觀察并且根據銀屑病面積和嚴重程度指數(psoriasis area and severity index,PASI)對小鼠皮損處的厚度、紅斑狀況、銀屑狀況進行評分。PASI評分標準為:0～4分,分別對應皮損程度無、輕度、中等、嚴重和極重度;總分為厚度、紅斑、鱗屑3項評分之和(0～12分),得分越高,皮損越嚴重[5]。

1.6 小鼠皮膚組織病理學觀察第8天處死小鼠當天,去小鼠背部皮損處皮膚,小鼠背部1/4的皮膚用4%多聚甲醛固定,其余組織放在-80 ℃保存。2周后石蠟切片、HE染色,在顯微鏡下觀看和拍照,隨機對每個切片選取3個位置,測其角質層到基底層的垂直距離,并對其進行統計分析。

1.7 免疫組化檢測小鼠皮膚中增殖及分化蛋白的表達將動物皮膚進行石蠟包埋法后切片,烤片2 h ,梯度脫蠟,PBS清洗,再加EDTA抗原結合修復液20 min后,用PBS清洗,再加入內源性過氧化物酶抑制劑15 min,然后滴加一抗(K1、K10、K6、K16、K17)4 ℃過夜,第2天取出,室溫放30 min,PBS清洗,二抗孵育,DAB顯色,用蘇木精復染,梯度脫水,中性樹脂封片,在顯微鏡下觀察。

1.8 ELISA檢測小鼠皮膚中蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、cAMP的表達ELISA試劑盒檢測小鼠背部皮損處皮膚中PKA、cAMP的表達,首先攪拌試劑使均勻,以防止形成氣泡而造成誤差,在各個標準品和待測樣品孔都設置2個復孔,再確定所需要的孔數。加檢測抗體孵育,洗板,加酶孵育,洗板后,加著色劑顯色反應,取出酶標板,再加終止液使化學反應完全停止,并立即在450 nm波長處測量各孔的吸光度值;繪制標準曲線,并算出PKA、cAMP的水平。

1.9 Western blot檢測小鼠皮膚中p-CREB水平蛋白的表達配制裂解溶液,RIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制劑=98 ∶1 ∶1,裂解液4 ℃裂解2 h,離心后,取其上清液;加入上樣緩沖液煮沸。電泳,轉膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,洗膜后加入p-CREB抗體孵育4 ℃ 過夜;第2天洗膜后二抗孵育2 h,洗膜、顯影,并分析灰度值。

2 結果

2.1 小鼠皮膚形態學觀察正常組小鼠皮膚光潔平整。模型組小鼠第1天開始就出現輕度鱗屑和增厚;第3天出現明顯的鱗屑和增厚癥狀;第5天鱗屑明顯增加并覆蓋大面積皮膚,增厚癥狀更加突出,紅斑也增加;第7天鱗屑幾乎遍布整個背部皮膚,表皮厚度也大大增加,出現明顯的紅斑。 Cri各劑量組和鹵米松組的小鼠前幾天皮損加重,但從第5天開始皮損處開始改善。見圖1。

2.2 Cri對小鼠皮膚PASI評分影響從第1天開始每天對實驗小鼠背部拍照觀察,按照PASI的評分標準進行評分。模型組小鼠從第2天開始有鱗屑、紅斑、增厚的情況。模型組小鼠增厚評分在7 d內持續升高,見圖2A;與模型組相比,Cri低劑量(F=10.17,P<0.05)組、Cri中劑量組(F=10.17,P<0.01)、高劑量組(F=10.17,P<0.01)和鹵米松組(F=10.17,P<0.01)增厚評分降低,差異有統計學意義。模型組小鼠鱗屑評分在6 d內不斷增加,見圖2B;與模型組相比,Cri中劑量組(F=4.43,P<0.01)、高劑量組(F=4.43,P<0.01)和鹵米松組(F=4.43,P<0.05)鱗屑評分降低,差異有統計學意義。模型組小鼠紅斑評分在6 d內不斷增加,見圖2C;與模型組相比,Cri低劑量(F=4.63,P<0.01)組、Cri中劑量組(F=4.63,P<0.01)、高劑量組(F=4.63,P<0.01)和鹵米松組(F=4.63,P<0.01)紅斑評分降低,差異有統計學意義。將各項評分相加后得到總分,總分在6 d內不斷增加,見圖2D;與模型組相比,Cri中劑量組(F=6.44,P<0.01)和高劑量組(F=6.44,P<0.01)總分降低,PASI評分差異有統計學意義;Cri各劑量組和鹵米松組間PASI評分差異無統計學意義。以上結果表明,Cri低、中、高劑量組和鹵米松組可以不同程度地改善小鼠皮膚的紅斑、鱗屑、增厚情況。

圖2 Cri對IMQ誘導的小鼠PASI評分的影響(n=8)

2.3 Cri對小鼠皮膚組織病理學和表皮厚度的影響HE染色后觀察小鼠皮膚病理改變,相較于正常組,模型組小鼠表皮明顯增厚、血管增生和炎癥細胞浸潤,角化不全或角化過度,顆粒層變薄,棘層肥厚以及棘層不規則延長。上述病理變化在各給藥組有不同程度改善。對病理切片隨機選取的3處角質層到基底層的垂直距離進行測量,取其平均值用Image J軟件進行統計學分析。與正常組相比,模型組表皮厚度明顯增厚,差異有統計學意義(F=57.78,P<0.01)。與模型組相比,Cri低劑量組(F=18.64,P<0.05)、中劑量組(F=18.64,P<0.01)、高劑量組(F=18.64,P<0.01)及鹵米松組(F=18.64,P<0.01)表皮厚度明顯減小,差異有統計學意義;與Cri低劑量組相比,Cri中劑量組(F=4.996,P<0.05)、高劑量組(F=4.996,P<0.05)及鹵米松組(F=4.996,P<0.05)表皮厚度明顯減小,差異有統計學意義;與鹵米松組相比,Cri中、高劑量組表皮厚度差異無統計學意義。見圖3。

2.4 Cri對小鼠皮膚組織中角質形成細胞增殖蛋白表達的影響免疫組化結果表明模型組小鼠在皮損部位的皮膚組織中K6、K16、K17蛋白表達水平高于正常組,差異有統計學意義(F=12.62、19.41、28.39,P<0.01)。與模型組比較,Cri高劑量組和鹵米松組K6蛋白表達降低,差異有統計學意義(F=12.62,P<0.01);Cri中、高劑量組和鹵米松組K16蛋白表達降低,差異有統計學意義(F=19.41,P<0.01);Cri中、高劑量組和鹵米松組K17蛋白表達明顯降低,差異有統計學意義(F=28.39,P<0.01)。Cri各劑量組與鹵米松組比較,K6、K16、K17的表達差異無統計學意義。以上結果提示模型組小鼠皮損處皮膚中角質形成細胞出現了過度增殖,Cri、鹵米松可以緩解角質形成細胞過度增殖。見圖4。

圖4 Cri對IMQ誘導的小鼠皮膚組織K6、K16、K17中表達的影響(n=3)

2.5 Cri對小鼠皮膚組織中角質形成細胞分化蛋白表達的影響模型組中K10、K1的表達水平明顯低于正常組,差異存在統計學意義(F=27.95、9.64,P<0.01),提示模型組小鼠皮損處皮膚中角質形成細胞出現了低分化。與模型組相比,Cri中、高劑量組及鹵米松組K10的表達增加,Cri高劑量組及鹵米松組K1的表達增加,提示中、高劑量的Cri以及鹵米松可以促進角質形成細胞分化。Cri各劑量組與鹵米松組比較,K10、K1的表達差異無統計學意義。見圖5。

圖5 Cri對IMQ誘導的小鼠皮膚組織K10、K1、中表達的影響(n=3)

2.6 Cri對IMQ誘導的銀屑病小鼠皮膚中cAMP-PKA-pCREB信號的影響與正常組相比,模型組小鼠皮膚中cAMP、PKA、pCREB水平下降,差異有統計學意義(FcAMP=41.89,P<0.01;FPKA=7.46,P<0.05;FpCREB=7.52,P<0.05)。與模型組相比,Cri組cAMP、PKA、pCREB水平升高,差異有統計學意義(FcAMP=48.94,P<0.01;FPKA=12.20,P<0.05;FpCREB=18.13,P<0.05);與模型組相比,鹵米松組cAMP、PKA水平升高,差異有統計學意義(FcAMP=48.94,P<0.01;FPKA=12.20,P<0.05)。提示Cri緩解小鼠銀屑病的作用與促進cAMP-PKA-pCREB 信號通路有關,見圖6。

圖6 Cri對IMQ誘導的小鼠皮膚組織中cAMP-PKA-CREB通路表達的影響(n=3)

3 討論

cAMP是調節多種細胞功能的第二信使,通過調節下游的信號分子,調節機體的炎癥免疫反應[6]。PDE4通過上調cAMP的水平,減少炎癥介質的生成,從而抑制銀屑病的發生、發展[7]。以PDE4作為靶點的PDE4抑制劑已經被開發用于治療銀屑病等慢性炎性疾病[[8]]。目前已經獲準用于銀屑病治療的PDE4抑制劑有口服阿普斯特,能夠明顯緩解銀屑病和銀屑病性關節炎的臨床表現,但有腹瀉、惡心等不良反應。外用PDE4抑制劑可以大大減少胃腸道不適的不良反應,外用Cri軟膏已經獲批用于治療特應性皮炎。有臨床研究[2]報道Cri軟膏對銀屑病有效,但作用機制不清楚。IMQ是一種Toll 樣受體和有效的免疫激活劑,小鼠皮膚上局部連續涂抹 IMQ可誘導小鼠銀屑病樣皮炎,模擬人銀屑病的發病和全身炎癥。IMQ誘導的小鼠銀屑病模型是公認的銀屑病動物模型,廣泛用于銀屑病的病理機制和藥物藥效學研究[9]。本研究利用銀屑病小鼠模型,探討Cri治療銀屑病的作用,結果發現Cri可以降低IMQ誘導銀屑病小鼠PASI 評分,改善皮膚鱗屑、增厚、紅斑、角化不全、角化過度、炎性浸潤等皮膚病理狀況,提示Cri對 IMQ 誘導的小鼠銀屑病有治療作用。

銀屑病的臨床特征為角質形成細胞異常增殖和分化。角質形成細胞先天性免疫反應失調可能導致炎癥失控和銀屑病的發生[10]。體外研究發現Cri體外可以降低人表皮角質形成細胞促炎因子TNFα、IL-1α 和 CXCL8的表達[4],提示角質形成細胞可能是Cri作用的靶細胞。角蛋白是角質形成細胞中的主要結構中間絲蛋白,在角質形成細胞的不同分化階段以高度特異性模式表達,維持角質形成細胞的結構穩定性和完整性。角蛋白已被廣泛用作各種上皮細胞增殖或分化階段以及表皮疾病診斷的標志蛋白,K10、K1是標記角質形成細胞分化的重要標記蛋白,K6、K16、K17的表達代表了病理條件下角質形成細胞的高度活化和增殖。角蛋白表達的變化可能引起表皮角質形成細胞的不完全分化,導致皮膚過度增生等[11]。本實驗結果表明,與正常組比較,模型組中表皮的K1、K10表達明顯降低,K6、K16、K17表達明顯升高,而Cri給藥后,K1、K10 表達明顯增強,K6、K16、K17表達則明顯降低;提示Cri能夠抑制角質形成細胞異常增殖,促使其正常分化,這或許與其改善IMQ引起的銀屑病小鼠的皮膚損傷的作用密切有關。

在炎癥免疫信號影響下,G蛋白偶聯受體通過Gαs活化腺苷酸環化酶(adenylate cyclase,AC),形成cAMP,并活化cAMP-PKA信號[12]。PKA活化引起 CREB的磷酸化,從而啟動基因的表達[13]。CREB活化后還能夠與NF-κB競爭性結合CBP、p300控制NF-κB的轉錄,從而降低NF-κB相關促炎因子基因的表達水平[14]。角質形成細胞的分化和角蛋白的表達受到cAMP-PKA-CREB信號的調節[15]。有研究表明牛蒡子苷元可以與PDE4D的催化結構域結合,通過抑制PDE4導致細胞內cAMP升高和CREB磷酸化,調節角蛋白的表達。Cri是PDE4的抑制劑,通過抑制PDE4活性,增加細胞內cAMP的含量,發揮抗炎免疫調節作用。本研究結果表明Cri能提高cAMP、PKA水平升高,促進CREB的磷酸化,提示Cri治療IMQ誘導的小鼠銀屑病可能與激活cAMP-PKA-CREB通路有關。