MLCK敲除對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響

熊 壘,黃建尚,周 青,汪 淵,左 莉

下咽癌是頭頸部腫瘤中預(yù)后最差的鱗狀細(xì)胞癌之一[1]。在發(fā)達(dá)國(guó)家并不常見(jiàn),它主要在吸煙和酗酒的男性中被診斷出來(lái),在女性中很少見(jiàn);但是在發(fā)展中國(guó)家,近年來(lái)下咽癌的發(fā)病率在男性和女性中都有所增加[2]。通常在晚期被發(fā)現(xiàn),且是多灶性的,盡管診斷成像、放射治療、化療和外科手術(shù)技術(shù)已經(jīng)得到改善,但5年存活率仍然很低[1]。因此迫切需要找到一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。肌球蛋白輕鏈激酶( myosin light chain kinase ,MLCK)是一種調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)鍵酶,已被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[3-4]。該課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)與健康組織比較,MLCK在下咽腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào),該研究旨在通過(guò)CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建MLCK敲除細(xì)胞株,并探討其對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(以色列Biological Industries 公司);Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(PI)(上海貝博生物科技有限公司);胰酶、青-鏈霉素、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);SteadyPure 通用型基因組DNA提取試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司);LipofectamineTMCRISPRMAXTMCas 9 轉(zhuǎn)染試劑、Modified sgRNA、Cas9 2NLS Nuclease(美國(guó)Synthego公司);2xS6 Universal SYBR qPCR MIX、HyperScriptTM Ⅲ RT SuperMix for qPCR with gDNA Remover(上海新貝生物科技有限公司);anti-Bax、anti-Bcl-2、anti-Caspase-3、anti-Cleaved Caspase-3 (美國(guó)CST公司);anti-Actin(美國(guó)Affinity公司);山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc Touch Imaging System(美國(guó)Bio-Rad公司);-80 ℃超低溫冰箱(日本三洋電器股份有限公司);正置生物顯微鏡(德國(guó)Leica公司);pH儀(上海雷磁儀器廠);電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1FaDu細(xì)胞培養(yǎng) FaDu細(xì)胞購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù),傳代至第三代,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h換液,待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)傳代,并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2FaDu細(xì)胞MLCK的敲除 利用Synthego公司提供的在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站,設(shè)計(jì)出MLCK特異性sgRNA序列UGUGUCCCAAGCUUUCCUUG,sgRNA由達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司代理購(gòu)買。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FaDu細(xì)胞按照1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)到30%～70%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分為對(duì)照組(不加Cas9 2NLS Nuclease 和sgRNA)和實(shí)驗(yàn)組(加0.5 μl Cas9 2NLS Nuclease 和1.5 μl sgRNA),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中均加入25 μl Opti-MEM培養(yǎng)基和1 μl Liprofectamine Cas 9 Plus Reagent,同時(shí)將1.5 μl CRISPRMAXTMReagent加入25 μl的Opti-MEM培養(yǎng)基中,5 min后將兩者混合并輕輕混勻,室溫孵育10 min后加到需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)孔中,培養(yǎng)2～3 d后將細(xì)胞消化接種于96孔板中,每孔1個(gè)細(xì)胞。

1.2.3MLCK敲除單克隆細(xì)胞株的PCR鑒定 當(dāng)96孔板內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)到2 000個(gè)左右時(shí),用胰酶消化細(xì)胞,將其接種于24孔板培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%融合度時(shí),用胰酶消化細(xì)胞,留取一半細(xì)胞提取DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證,另一半細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。提取基因組DNA的方法如下:胰酶消化FaDu細(xì)胞后取一半細(xì)胞1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入200 μl的PBS懸浮細(xì)胞;加入180 μl Buffer BS-2、20 μl的Proteinase K和10 μl RNaseA(10 mg/ml),收集細(xì)胞懸液,充分吸打混勻,于56 ℃水浴加熱10 min至溶液完全裂解成澄清透明狀態(tài);向裂解液中加入200 μl無(wú)水乙醇,充分吸打混勻;然后將上述溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中,具體操作參見(jiàn)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR擴(kuò)增體系為:Premix Taq 25 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,DNA模板1 μl,ddH2O 22 μl。PCR擴(kuò)增條件為:98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)120 V電壓、1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離鑒定。將PCR鑒定為陽(yáng)性的擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4RT-qPCR檢測(cè)MLCK mRNA表達(dá) 收集經(jīng)測(cè)序確定MLCK敲除的2株細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,使用ES Science公司的RNA快速提取試劑盒提取總RNA,測(cè)定RNA純度和濃度后,用上海新貝生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,用安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院公共實(shí)驗(yàn)室羅氏 LightCycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,按照試劑盒操作方法檢測(cè)各組細(xì)胞MLCK mRNA表達(dá)水平,采用2-△△Ct法計(jì)算MLCK mRNA相對(duì)表達(dá)量。MLCK引物序列F:5′-ATGTCAGCATAAGGGGAAGGGG-3′,R: 5′- GCTCATTTCACTAAGCATGTTCC-3′;GAPDH引物序列F:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,R: 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞按照5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔板中,待細(xì)胞融合密度達(dá)到90%時(shí),胰酶消化收集細(xì)胞,以1 000 r/min離心5 min;取沉淀細(xì)胞,用冷PBS洗滌細(xì)胞2次,用500 μl PBS重懸細(xì)胞,滴加2 ml冷乙醇4 ℃固定過(guò)夜;取5×106個(gè)細(xì)胞,在15 ml錐形離心管中2 000 r/min離心10 min,棄上清液,收集細(xì)胞;用冷PBS洗滌細(xì)胞2次,用500 μl冷PBS重懸細(xì)胞,加入RnaseA溶液20 μl,37 ℃水浴30 min;用400目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾,在2 000 r/min離心10 min,棄上清液,收集細(xì)胞;加入400 μl PI染液重懸細(xì)胞,輕輕混勻后4 ℃避光孵育1 h,最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞按照5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔板中,待細(xì)胞融合密度達(dá)到90%時(shí),用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,用冷PBS洗滌2次,用400 μl 1× Annexin V結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞,在細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻后于4 ℃避光條件下孵育15 min,加入5 μl PI染色液后輕輕混勻于4 ℃避光條件下孵育5 min,通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)MLCK敲除組和對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)并分析細(xì)胞凋亡率的變化,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MLCK敲除和對(duì)照組細(xì)胞,按照5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔板中,待細(xì)胞融合密度達(dá)到90%時(shí),吸棄培養(yǎng)基,用PBS洗3次,每孔加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上充分裂解細(xì)胞,14 000 r/min 4 ℃離心20 min。吸取上清液,用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。以4 ∶1的比例加入相應(yīng)體積的總蛋白和5×蛋白上樣緩沖液,震蕩混勻后在100 ℃水浴中煮沸15 min使蛋白完全變性,冷卻后置于-80 ℃冰箱中保存。電泳時(shí)每泳道加入10 μg的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,加一抗4 ℃孵育過(guò)夜,用TBST溶液洗滌3次,每次5 min,室溫孵育二抗2 h,再用TBST洗滌3次后,即可進(jìn)行曝光,檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況,使用Image J分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 FaDu細(xì)胞MLCK敲除的測(cè)序結(jié)果根據(jù)Synthego 公司網(wǎng)站上提供的在線CRISPR Design Tool,選擇靶向MLCK基因第2外顯子上的sgRNA,提取DNA后進(jìn)行PCR鑒定,并將陽(yáng)性樣本送測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示MLCK KO 1細(xì)胞株在sgRNA識(shí)別序列處缺失了4個(gè)堿基(圖1A),MLCK KO 2細(xì)胞株則在識(shí)別序列發(fā)生了堿基的插入與替換(圖1B),表明成功構(gòu)建了MLCK KO 1和MLCK KO 2細(xì)胞株。

2.2 敲除MLCK對(duì)FaDu細(xì)胞MLCK mRNA和蛋白表達(dá)的影響收集培養(yǎng)的FaDu細(xì)胞株,RT-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中MLCK mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,MLCK敲除細(xì)胞株中mRNA表達(dá)量降低(F=903.8,P<0.000 1,圖2A)。Western blot方法鑒定細(xì)胞中MLCK蛋白表達(dá),MLCK敲除組中蛋白水平降低(F=2742,P<0.000 1,圖2B)。

2.3 敲除MLCK對(duì)FaDu細(xì)胞周期的影響在FaDu細(xì)胞中敲除MLCK,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,MLCK敲除組細(xì)胞周期各時(shí)期變化并不明顯,這說(shuō)明敲除MLCK不影響細(xì)胞的增殖(圖3)。

圖3 MLCK敲除對(duì)FaDu細(xì)胞周期的影響

2.4 敲除MLCK對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響在FaDu細(xì)胞中敲除MLCK,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,MLCK敲除組凋亡增加,這說(shuō)明敲除MLCK會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡(F=93.52,P<0.000 1,圖4 )。

圖4 敲除MLCK 對(duì)FaDu細(xì)胞增殖的影響

2.5 敲除MLCK對(duì)FaDu細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3以及Cleaved Caspase-3表達(dá)的影響Western blot 方法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,MLCK敲除組Bax和Bcl-2的比值(F=99.40,P<0.000 1)以及Cleaved Caspase-3與Caspase-3的比值(F=31.17,P=0.000 7)均增加,說(shuō)明MLCK敲除誘發(fā)細(xì)胞凋亡(圖5)。

圖5 敲除MLCK對(duì)FaDu細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

下咽癌相對(duì)罕見(jiàn),約占所有頭頸部惡性腫瘤的3%,惡性程度高,為頭頸部預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[5]。早期無(wú)特征性臨床表現(xiàn),一般下咽癌患者總是在中晚期才被診斷出來(lái),預(yù)后較差。因此,有必要尋找新的標(biāo)志物,為患者提供早期發(fā)現(xiàn)和治療。本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)MLCK在人下咽癌組織中的表達(dá)高于正常的鄰近組織,且與5年生存率有關(guān),MLCK高表達(dá)患者的生存率較低,提示MLCK可能是潛在治療腫瘤的有效靶點(diǎn)。MLCK蛋白由MYLK基因編碼,MYLK基因是一個(gè)單拷貝基因,含有2個(gè)啟動(dòng)子,分別轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)MLCK和短MLCK,短MLCK又稱平滑肌MLCK[6]。研究[7]報(bào)道,MLCK是免疫介導(dǎo)的屏障喪失的主要調(diào)節(jié)因子,MLCK特異性抑制劑可緩解TNF和抗CD3抗體誘導(dǎo)的屏障喪失,而MLCK敲除可保護(hù)TNF和抗CD3誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)生。研究[8-9]表明,潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病中MLCK的表達(dá)明顯增加。免疫活化誘導(dǎo)的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的研究[10]顯示MLCK在GVHD患者組織中明顯升高,而MLCK敲除限制GVHD的進(jìn)展。此外,同型半胱氨酸可增加Caco 2細(xì)胞中MLCK蛋白的表達(dá),從而引起跨上皮電阻的降低,增加上皮細(xì)胞通透性[11]。MLCK除了在維持上皮細(xì)胞屏障通透性平衡中具有重要作用外,另外一些研究[3-4,12]顯示MLCK影響細(xì)胞的增殖和凋亡。研究[13]表明,在肝癌細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)MLCK減少細(xì)胞凋亡,而抑制MLCK增加細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡的主要途徑有死亡受體途徑和以線粒體凋亡途徑,線粒體信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起著重要作用。線粒體凋亡途徑上Bcl-2蛋白家族作為參與細(xì)胞凋亡的核心家族,對(duì)凋亡的意義尤為重要[14]。

目前尚無(wú)報(bào)道對(duì)下咽癌MLCK敲除引起細(xì)胞凋亡的研究,本課題組為了進(jìn)一步探索MLCK在下咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用,首先利用CRISPR/Cas 9技術(shù)敲除MCLK,構(gòu)建MLCK敲除的FaDu細(xì)胞株。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)MLCK敲除細(xì)胞株堿基序列發(fā)生缺失或替換,并通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)敲除效率,發(fā)現(xiàn)MLCK敲除組mRNA和蛋白水平低于對(duì)照組,說(shuō)明MLCK敲除株構(gòu)建成功。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn),MLCK敲除并不影響細(xì)胞增殖,但誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這決定了MLCK在下咽癌中起癌基因的作用。此外,敲除MLCK,Western blot結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白:Bax、Caspase-3以及Cleaved Caspase-3表達(dá)增加,然而,本研究中課題組發(fā)現(xiàn)一個(gè)現(xiàn)象,即MLCK敲除組中Bcl-2的表達(dá)水平與對(duì)照組相比增高,而不是降低。造成這種現(xiàn)象的原因可能為MLCK敲除引起細(xì)胞啟動(dòng)自身的應(yīng)急保護(hù)機(jī)制,調(diào)用自身抗凋亡系統(tǒng)來(lái)抵抗損傷,但是Bax與Bcl-2的比值MLCK敲除組與對(duì)照組相比增高,說(shuō)明MLCK敲除組細(xì)胞發(fā)生凋亡,結(jié)合Cleaved Caspase-3/Caspase-3增高,進(jìn)一步說(shuō)明敲除MLCK誘導(dǎo)下咽癌細(xì)胞的凋亡,但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究構(gòu)建了MLCK敲除的2株細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實(shí)驗(yàn)證明MLCK敲除誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為進(jìn)一步開(kāi)展MLCK在下咽癌的功能和作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。