Wnt2/β-catenin通路在C57BL/6小鼠肝再生修復中的變化

姚路遠,劉 云,楊 茜,鮑 欣,王 琰,趙小英,唐俊明

肝再生是一個復雜的過程,涉及肝臟中的多種細胞類型,包括肝細胞、肝星狀細胞、肝竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)和Kupffer細胞等[1]。肝細胞是主要的實質(zhì)細胞,占肝功能的很大一部分[2]。健康的肝臟中細胞有絲分裂是靜止的,但在受損傷或切除后,細胞可以迅速進入細胞周期,恢復肝臟的質(zhì)量和功能。在肝再生過程中,肝實質(zhì)細胞和LSEC密切配合促進肝臟質(zhì)量和功能的修復[1]。Wnt基因最初來源于小鼠乳腺癌中的整合酶-1和果蠅的無翅基因,Wnt通路也被稱為Wnt2/ β-catenin通路,涉及β-catenin的核轉(zhuǎn)位。β-catenin進入細胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子激活靶基因,該通路主要控制細胞增殖[3]。既往研究[4]表明Wnt2/β-catenin通路在肝臟發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和代謝中起著關鍵作用,但其在肝臟再生修復中的作用尚不清楚。該研究旨在探討小鼠部分肝切除術(partial hepatectomy, PHx)后,肝再生修復過程中Wnt2/β-catenin的表達特征及作用,為臨床中PHx后的患者改善肝臟功能,降低術后病死率提供理論基礎和新的靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 11周齡C57BL/6小鼠,雄性,體質(zhì)量24～30 g,購自湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心,飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中,動物許可證號SYXK(鄂)2019-0031,湖北醫(yī)藥學院實驗動物倫理委員會批準[批準號:湖北醫(yī)藥學院動(福)第2021-實029號]。

1.1.2主要試劑 異氟烷購自美國RWD公司;TRIzol購自美國Ambion公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)生化分析試劑盒 、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST) 生化分析試劑盒購自南京建成生物技術研究所;組織自發(fā)熒光淬滅劑A液、B液購自武漢賽維爾生物科技有限公司;防淬滅封片劑購自美國Southern Biotech公司 ;蘇木精購自武漢賽維爾生物科技有限公司;Anti-LYVE1 Rabbit pAb、Anti-HNF-4-α Rabbit mAb購自英國Abcam公司;Anti-Ki67 Mouse mAb購自武漢賽維爾生物科技有限公司;Anti-GAPDH Mouse pAb購自美國Bioworld公司。HRP Goat Anti Rabbit IgG H+L、HRP Goat Anti Mouse IgG H+L購自武漢安特捷生物技術有限公司;熒光二抗AlexaFluor?594 Donkey Anti-Mouse IgG H+L、AlexaFluor?488 Donkey Anti-Rabbit IgG H+L購自美國Jackson Immuno Research公司;PMSF購自大連美侖生物技術有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;ECL試劑盒購自美國Millipore公司;RIPA 購自大連美侖生物技術有限公司;DAPI購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠肝切除再生模型構(gòu)建 11周齡C57BL/6雄鼠隨機分為6組,Sham組、術后1 d組、術后2 d組、術后4 d組、術后6 d組、術后8 d組,手術均在SPF環(huán)境中操作。術前稱體質(zhì)量,用異氟烷麻醉后,將小鼠置于保溫墊上,膠帶固定四肢。用碘伏消毒腹部3遍,橫切口打開腹腔,分別用棉簽暴露出肝左葉和中葉,用棉線結(jié)扎肝左葉和中葉根部并切除。檢查殘端無出血后,用4#手術縫合線迅速縫合傷口,Sham組僅腹腔切開后縫合處理。

1.2.2肝功能檢測 行PHx后,于術后1、2、4、6、8 d取材,小鼠經(jīng)吸入異氟烷麻醉后,心尖取血,經(jīng)4 ℃,3 500 r/min 離心10 min后,收取血漿,利用南京建成公司AST、ALT試劑盒檢測血漿中肝功能指標AST、ALT水平變化,分析術后小鼠肝功能情況。

1.2.3免疫組化染色 組織依次固定、脫水、透明、浸蠟、包埋,組織切片5 μm。將切片脫蠟、復水后置于pH6.0 枸櫞酸鈉中,放入微波爐抗原修復。PAP阻水筆畫圈后每個組織加30 μl 3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶,PBS洗滌3次,每次5 min。含0.3%Triton X-100的5%山羊血清封閉液室溫封閉1 h,去除封閉液后,于每組切片分別滴加30 μl 一抗Anti-Ki67(1 ∶600),濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。放入室溫復溫30 min后用含0.1%吐溫-20的PBS溶液洗滌3次,每次5 min。用山羊抗小鼠二抗(1 ∶600)室溫孵育1 h,PBST洗滌3次,每次5 min。DAB染色后超純水沖洗5 min,蘇木精復染核1.5 min,超純水沖洗10 min。1%鹽酸乙醇分化5 s后超純水洗,PBS返藍后梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.2.4免疫熒光染色 將上述組織抗原修復后,用組織自發(fā)熒光淬滅劑A液30 μl室溫孵育30 min,超純水沖洗5 min。用5%驢血清室溫封閉1 h,一抗Anti-Ki67(1 ∶600)、Anti-HNF-4-α,(1 ∶2 000)、Anti-LYVE1(1 ∶1 000)、Anti-β-catenin(1 ∶100),4 ℃孵育過夜。放入室溫復溫30 min后用PBST溶液洗滌3次,每次5 min。加入熒光二抗(1 ∶500)室溫孵育1 h,PBST洗3次,每次5 min,DAPI(1 ∶2 000)復染細胞核5 min。PBST洗3次,每次5 min,滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑B液30 μl室溫避光孵育5 min,超純水沖洗5 min,PBS中洗滌3次,每次5 min,切片稍甩干后滴加防淬滅封片劑封片。

1.2.5Western blot檢測Wnt2的表達變化特征 取各時間點肝臟組織 50 mg 于EP管中,加入RIPA和PMSF混合物 500 μl(RIPA ∶PMSF=100 ∶1),多通道組織勻漿機勻漿。冰上靜置30 min后,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,離心后取上清液即為肝組織總蛋白。采用 BCA 蛋白濃度檢測試劑盒對各組肝組織蛋白樣品進行BCA定量分析后,加入1/4體積的5×上樣緩沖液煮沸 5 min 使蛋白變性。行SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離;220 mA、60 min 的條件下轉(zhuǎn)至 PVDF 膜,5%脫脂牛奶室溫封閉 PVDF 膜1 h;一抗Anti-Wnt2 (1 ∶1 000)、Anti-GAPDH (1 ∶10 000) 4 ℃孵育過夜,TBST 漂洗 3 次;二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h,TBST 漂洗3次。使用 ECL 試劑盒顯影成像,使用Image J軟件測量Wnt2和GAPDH灰度值,并用Wnt2/GAPDH進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 PHx后肝質(zhì)量變化的時間動力學特征為了觀察PHx后不同時間點小鼠肝質(zhì)量變化的特征,分別于PHx后1、2、4、6、8 d稱取小鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量。與Sham組比較,術后第1天肝體積最小,第2天體積開始變大,到術后第6天達到高峰(圖1)。肝切后第1天肝質(zhì)量、肝質(zhì)量/體質(zhì)量最低(P<0.000 1),第6天就恢復到接近Sham組水平(表1)。經(jīng)統(tǒng)計學分析,各組肝質(zhì)量和肝質(zhì)量/體質(zhì)量結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(肝質(zhì)量:F=26.317,P<0.000 1;肝質(zhì)量/體質(zhì)量:F=47.527,P<0.000 1)。結(jié)果表明,小鼠PHx后肝臟具有強大的再生修復能力,能快速使肝質(zhì)量恢復至相對正常水平。

表1 PHx后肝質(zhì)量變化的時間動力學特征

圖1 PHx后各組肝組織形態(tài)變化

2.2 PHx后肝功能變化的時間動力學特征為了觀察PHx后肝臟質(zhì)量變化過程中肝臟功能變化的特征,于PHx后1、2、4、6、8 d收集血漿,用ALT、AST試劑盒檢測血漿中肝臟功能指標ALT和AST的水平。結(jié)果顯示肝切后ALT、AST水平均于第1天顯著升高(ALT:P<0.01;AST:P<0.001),第2天迅速恢復至接近正常水平,到第4天完全恢復到Sham組水平(圖2)。經(jīng)統(tǒng)計學分析,各手術組和Sham組之間的肝功能水平差異有統(tǒng)計學意義(ALT:F=33.916,P<0.000 1;AST:F=62.559,P<0.000 1)。這一結(jié)果提示PHx后肝臟再生修復過程中,肝臟的功能迅速從損傷狀態(tài)恢復到正常水平。

圖2 PHx后肝功能變化的時間動力學特征

2.3 PHx后肝臟細胞增殖能力變化特征為了探索PHx后肝臟再生修復與細胞增殖變化的關系,行Ki67免疫組化染色。與Sham組比較,PHx后肝臟Ki67陽性細胞數(shù)于第1天開始增多,于第2天達到高峰(P<0.000 1),從第4天開始逐漸下降,第8天恢復到接近正常水平。經(jīng)統(tǒng)計學分析,各手術組和Sham組之間的Ki67陽性細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(F=214.981,P<0.000 1)。為了探明Ki67陽性細胞的種類,本研究分別用肝實質(zhì)細胞的特異標志物HNF4-α和LSEC的特異標志物LYVE1與Ki67做免疫熒光共定位,結(jié)果顯示 HNF4-α和Ki67雙陽性細胞數(shù)于第1天開始增多,第2天達到高峰(P<0.000 1),然后逐漸下降,第6天恢復到接近正常水平。經(jīng)統(tǒng)計學分析,手術組和Sham組之間的HNF4-α、Ki67雙陽性細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(F=100.037,P<0.000 1)。LYVE1和Ki67雙陽性細胞數(shù)在術后第1天降低,第4天升高達到峰值(P<0.000 1),第6天開始降低,于第8天恢復至Sham組水平。經(jīng)統(tǒng)計學分析,各手術組和Sham組之間的LYVE1、Ki67雙陽性細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(F=31.13,P<0.0001)。結(jié)果表明,PHx后第2天主要是肝細胞增殖,第4、6天主要是LSEC增殖。見圖3。

圖3 PHx后肝臟細胞增殖能力變化特征

2.4 PHx后小鼠肝組織Wnt2/β-catenin表達變化情況為研究Wnt2/β-catenin通路與肝再生的關系,先檢測了PHx后肝臟中Wnt2蛋白的表達。Western blot結(jié)果顯示,與Sham組比較,術后第1天和第4天Wnt2蛋白表達達到峰值(P<0.000 1,P<0.001),見圖4。經(jīng)統(tǒng)計學分析,手術組和Sham組之間的Wnt2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=43.89,P<0.000 1)。表明Wnt2通路可能參與了肝再生修復過程;進一步檢測了β-catenin被激活轉(zhuǎn)入核內(nèi)的情況,β-catenin免疫熒光定位結(jié)果顯示,術后第1、2、6、8天β-catenin入細胞核數(shù)顯著增多(P<0.001,P<0.01,P<0.001,P<0.05),見圖5。經(jīng)統(tǒng)計學分析,手術組和Sham組之間的β-catenin入核細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(F=66.465,P<0.000 1)。上述結(jié)果表明肝再生修復過程中Wnt2/β-catenin通路被激活。

圖4 PHx后肝組織中Wnt2蛋白表達的變化特征

圖5 PHx后肝組織中β-catenin激活的變化特征

3 討論

肝臟是一種具有豐富的再生能力的獨特器官。因此,PHx或部分肝移植可以安全進行[5]。PHx后門靜脈血流或壓力的劇烈變化、組織缺血/缺氧可能是肝再生的主要觸發(fā)因素和驅(qū)動力[6]。肝臟是唯一一個利用再生機制來確保肝質(zhì)量/體質(zhì)量始終達到體內(nèi)平衡所需質(zhì)量的100%的實體器官[7]。本研究發(fā)現(xiàn),PHx后小鼠肝質(zhì)量、肝質(zhì)量/體質(zhì)量逐漸升高,第6天達到高峰,接近Sham組水平。PHx后受損、壞死的肝細胞釋放ALT、AST入血,同時門靜脈血流或壓力的劇烈變化、肝組織缺血、缺氧觸發(fā)肝再生修復。本研究結(jié)果顯示,在術后第1天ALT、AST水平顯著升高,第2天迅速恢復至接近正常水平。小鼠肝功能恢復的峰值和Ki67陽性細胞數(shù)峰值一致,提示PHx后肝臟中的細胞快速增殖促進了肝功能的恢復。因此,在肝損傷修復的早期,提高患者肝臟中細胞的增殖能力,是減少肝切除術后肝功能衰竭可能的策略。

肝再生是一個復雜的過程,涉及多種細胞類型的對話,包括肝細胞、肝星狀細胞、內(nèi)皮細胞和炎癥細胞。健康的肝臟細胞有絲分裂是靜止的,但在毒性損傷或切除后,細胞可以迅速進入細胞周期,恢復肝臟的質(zhì)量和功能。在這個再生過程中,實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞以一種緊密協(xié)調(diào)的方式進行反應[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)在PHx后第2天肝實質(zhì)細胞增殖達到高峰,從第4天開始逐漸降低;而LSEC增殖在PHx后第1、2天降低,第4天達到增殖高峰,第6天開始降低。這一結(jié)果說明了PHx后2～4 d是肝再生修復的關鍵階段,肝實質(zhì)細胞和LSEC分別起著重要作用,共同促進肝臟再生修復。

Wnt2/β-catenin信號通路對胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[10]。研究[11-12]表明該通路在肝臟的發(fā)育、成熟和分化中也扮演著重要角色。在無Wnt配體的情況下,破壞復合物(CK1α、GSK3β、Axin、APC蛋白形成的復合物)可磷酸化β-catenin,靶向其進行泛素依賴性蛋白酶體降解。當配體Wnt結(jié)合其同源受體Frizzled和共受體LRP5/6時,破壞復合物被招募到細胞膜上,從而減少破壞復合物對β-catenin的降解。β-catenin在細胞質(zhì)中積累,并轉(zhuǎn)入細胞核激活下游靶基因[13-14]。在成熟的健康肝臟中,Wnt2/β-catenin通路大多不活躍,但在細胞更新或再生過程中,以及在某些病理條件,如疾病、惡性腫瘤中會重新激活。本研究發(fā)現(xiàn),PHx后第1天和第4天Wnt2表達增加;β-catenin在第1天入核增加,第2天肝實質(zhì)細胞增殖就達到峰值;術后第2天β-catenin入核增加,第4天LSEC增殖達到峰值。該結(jié)果預示了Wnt2/β-catenin通路的激活,直接或者間接參與了肝臟再生修復。

β-catenin被激活入核主要出現(xiàn)在PHx后第1、2、6和8天,而Wnt2蛋白表達的峰值在第1天和第4天,即第4天Wnt2蛋白表達峰值的時間在第2天β-catenin入核之后,提示β-catenin受Wnt2激活入核,并正反饋促進Wnt2的表達,下一步課題組將對該現(xiàn)象的機制進行研究。

綜上所述,小鼠PHx后,肝臟有強大的再生修復能力,能使肝臟功能快速恢復至正常水平。本研究證實了肝實質(zhì)細胞和LSEC增殖的同時Wnt2/β-catenin通路被激活,說明該通路在小鼠肝臟再生修復中有重要作用,具體的作用與機制需要進一步研究。該課題為臨床患者PHx后肝功能的恢復,防治肝功能衰竭提供了新的靶標和理論基礎。