雙氫青蒿素抑制非小細胞肺癌細胞遷移侵襲和血管生成擬態的初步研究

胡冰琪,周 靜,黃俊峰,陳禮文

肺癌是癌癥相關死亡的主要原因之一,轉移作為肺癌發展的關鍵階段,與70%以上的死亡有關[1]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細胞獲得間質特征的過程。在癌癥中,EMT與腫瘤起始、侵襲、轉移和治療耐藥性相關[2]。血管生成擬態(vasculogenic mimicry,VM)是近年來在許多惡性腫瘤中發現的一種血管生成過程,涉及由腫瘤細胞組成的微血管通道的形成。因此,VM被認為是侵襲性腫瘤血管形成的新模型,可以為腫瘤生長提供血液供應[3]。

雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的第一代衍生物,因其療效好、毒性低等特點,被用于臨床抗瘧治療[4]。近年來,研究表明雙氫青蒿素在肝癌[5]、卵巢癌[6]、胰腺癌[7]等多種腫瘤中起抗癌作用。但在肺癌中,DHA是否發揮抗癌效應及其可能的抗癌機制還有待探究。該研究使用DHA處理非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549和H3255細胞來檢測對EMT過程中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和VM的標志物VE-cadherin表達的影響,并采用一系列細胞功能實驗探討DHA對NSCLC細胞的轉移侵襲和VM的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料A549、H3255細胞采購于上海富恒生物技術有限公司;RPMI1640培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司;0.25%胰酶消化液、1%青-鏈霉素、CCK8試劑和RIPA裂解液購于上海碧云天生物技術有限公司;總RNA提取試劑盒購于新貝(上海)生物科技有限公司;E-Cadherin 抗體購于美國Affinity Biosciences公司;N-Cadherin 抗體購于美國 Cell Signaling Technology公司;Vimentin抗體、VE-Cadherin抗體購于英國 Abcam公司;山羊抗兔(H+L) HRP和山羊抗小鼠(H+L) HRP 購于美國 Affinity Biosciences公司;Western blot顯影儀購于上海天能科技有限公司;Matrigel Matrix 基質膠和Transwell小室購于美國 Corning公司。

1.2 實驗藥物DHA(純度>97%)購于美國Selleck公司、DMSO購于上海碧云天生物技術有限公司,DHA用DMSO充分溶解配成100 mmol/L的母液,水浴鍋50 ℃水浴助溶,-20 ℃保存。在實驗前用RPMI1640培養基稀釋母液至所需使用的濃度(使DMSO終體積分數<0.1%)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 向RPMI1640培養基中加入10%胎牛血清和1%的青-鏈霉素,配制成新鮮培養基,在5% CO2、飽和濕度條件下的37 ℃培養箱里培養A549和H3255細胞。

1.3.2CCK8實驗 將A549和H3255細胞以5×103個/孔的密度鋪進96孔板中。待細胞過夜貼壁后,加入不同濃度的DHA(0、5、10、25、50、100 μmol/L)放置37 ℃培養箱培養。到待測時間后,以1 ∶10的比例將CCK8試劑和RPMI1640培養基混合,將96孔板中的培養基吸出,加入配好的溶液,1 h后酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.3.3Transwell實驗 Matrigel Matrix基質膠和無血清RPMI 1640培養基按1 ∶3的比例配置。向小室內加入 60 μl所配制的基質膠溶液,置于 37 ℃培養箱烘干。其中,僅侵襲實驗需使用含基質膠的無血清溶液,遷移實驗無需基質膠。細胞數量為:遷移實驗每小室 5×104個,侵襲實驗每小室 1×105個。向小室的下室加入600 μl含30%胎牛血清的RPMI1640 培養基,放置37 ℃培養箱中培養。加入4%多聚甲醛細胞固定液,0.1%結晶紫溶液染色。觀察結果并拍照。

1.3.4三維細胞培養 將Matrigel Matrix 基質膠和無血清培養基1 ∶1配置,向96孔板每孔加入配置好的含基質膠培養基溶液50 μl,放置37 ℃培養箱烘干1 h。96孔細胞培養板中每孔加入5×105個/ml細胞,終體積為 100 μl的細胞懸液。然后將96孔板放至37 ℃細胞培養箱培養6～12 h。最后將 96 孔板置于倒置顯微鏡觀察高倍鏡視野下,觀察孔內外細胞的血管樣形態生成情況并拍照記錄。實驗重復3次。

1.3.5RNA提取與qRT-PCR實驗 總RNA按廠家說明書用TRIzol試劑提取,然后逆轉錄成cDNA,qRT-PCR檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、VE-cadherin和內參GAPDH的表達水平,引物序列見表1,反應條件為95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s。

表1 引物序列

1.3.6Western blot實驗 加入RIPA裂解液收集細胞上清,進行SDS-PAGE蛋白電泳后,將蛋白質信息轉移至PVDF膜(0.45 μm)上,切膜后,將條帶放入5%脫脂牛奶中封閉2 h。一抗E-cadherin(兔源單抗1 ∶2 000稀釋)、N-cadherin(兔源單抗1 ∶1 000稀釋)、 Vimentin(兔源單抗1 ∶3 000稀釋)和VE-cadherin(兔源單抗1 ∶1 000稀釋),GAPDH(兔源多抗1 ∶5 000稀釋),4 ℃冰箱里過夜;HRP二抗(1 ∶5 000稀釋)37 ℃孵育1.5 h,置于化學發光成像儀內顯影,用Image J圖像分析軟件對各組蛋白條帶進行灰度值測定,實驗重復3次。

2 結果

2.1 DHA抑制A549和H3255細胞的生長在96孔板中鋪細胞后,加入不同濃度的DHA(0、5、10、25、50、100 μmol/L),分別處理24、48、72 h后,加入CCK8溶液進行檢測。與對照組(DHA濃度為0 μmol/L)比較,DHA處理后的實驗組細胞生存能力受到抑制,A549和H3255細胞存活率下降,并呈濃度和時間依賴性。A549和H3255的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為52.17 μmol/L和46.06 μmol/L。故后續實驗均使用50 μmol/L的DHA。見圖1。

圖1 不同濃度的DHA對A549和H3255的生長抑制程度

2.2 DHA抑制A549和H3255細胞的遷移與侵襲能力Transwell實驗檢測DHA是否對肺癌細胞株的遷移和侵襲產生影響,用DHA處理A549和H3255細胞,24 h后觀察遷移實驗的結果,48 h后觀察侵襲實驗的結果,觀察并拍照穿過基質膠的數量。24 h后,與對照組比較,DHA組A549和H3255細胞遷移數量減少,表明DHA抑制A549和H3255細胞遷移能力,差異有統計學意義(A549:t=-19.190,P<0.001;H3255:t=-24.678,P<0.001),見圖2A、B。48 h后,與對照組比較,DHA組穿過基質膠的A549和H3255細胞侵襲數量減少,表明DHA抑制A549和H3255細胞的侵襲能力,差異有統計學意義(A549:t=-33.080,P<0.001;H3255:t=-51.824,P<0.001),見圖2C、D。

圖2 DHA抑制A549和H3255細胞的遷移與侵襲

2.3 DHA影響EMT進程相關分子mRNA和蛋白表達qRT-PCR檢測EMT標志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的mRNA表達水平。結果顯示:在A549和H3255細胞中,DHA組E-cadherin的mRNA表達上升(A549:t=11.445,P<0.001;H3255:t=20.068,P<0.001),N-cadherin的mRNA表達下降(A549:t=-5.847,P=0.004;H3255:t=-5.233,P=0.006),Vimentin的mRNA表達水平同樣也下降(A549:t=-8.333,P=0.001;H3255:t=-13.629,P<0.001),見圖3A。進一步用Western blot技術驗證E-cadherin,N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平。DHA作用于A549和H3255細胞24 h后,與對照組比較,DHA組除上皮樣細胞標志物E-cadherin的蛋白表達水平上升(A549:t=24.571,P<0.001;H3255:t=6.062,P=0.004),N-Cadherin(A549:t=-52.589,P<0.001;H3255:t=-50.409,P<0.001)及Vimentin(A549:t=-25.730,P<0.001;H3255:t= -34.694,P<0.001)蛋白表達水平均下降,見圖3B、C。

圖3 DHA影響A549和H3255細胞EMT相關分子mRNA和蛋白表達

2.4 DHA抑制VM形成及VE-cadherin表達為了探究DHA對VM的影響,使用三維細胞培養技術檢測對照組和DHA組的血管樣結構生成情況。在37 ℃培養箱培養12 h之后,DHA抑制肺癌細胞血管樣結構生成,即抑制VM的形成,見圖4A。qRT-PCR結果表明,DHA抑制了VM標志物VE-cadherin的mRNA水平表達(A549:t=-10.846,P<0.001;H3255:t=-6.443,P=0.003),見圖4B。Western blot實驗進一步驗證,DHA也抑制了VE-cadherin的蛋白表達水平,差異有統計學意義(A549:t=-37.691,P<0.001;H3255:t=-11.006,P<0.001),見圖4C。以上結果表明,DHA抑制VM的形成。

3 討論

肺癌導致全球癌癥相關死亡人數最多。目前,這些病例中超過 85% 被歸類為NSCLC,預計 5 年生存率僅為 15.9%,在過去的幾十年里,這個數據僅略有改善[8]。小分子酪氨酸激酶抑制劑和免疫療法極大的改善了NSCLC患者的生存益處。然而,NSCLC的總體治愈率和生存率仍然很低,特別是在轉移性疾病中[9]。因此,尋找一種抑制NSCLC轉移和抑制其腫瘤進程的安全高效的藥物顯得尤為重要。青蒿素是一種被廣泛認可及應用的抗瘧疾藥物,DHA是其第一代衍生物,具有水溶性好,毒性低等特點,其抗癌效應在近年來成為熱點。如通過自噬來抑制肝癌細胞HepG2.2.15的增殖[10],在食管鱗癌中以人端粒酶逆轉錄酶為靶點抑制增殖、轉移和侵襲[11]等。

轉移是癌癥相關死亡的主要原因,因此,抑制轉移是改善臨床結果中非常重要的一環。EMT是一種進化上保守的發育程序,它與致癌作用有關,并通過增強移動性、侵襲性賦予癌細胞轉移特性。EMT的復雜生物學過程被認為是致癌的關鍵標志,而靶向EMT途徑成為了一種有吸引力的癌癥治療策略[12]。EMT的標志是失去上皮表面標志物,最顯著的是E-cadherin,以及獲得間充質標志物,包括Vimentin和N-cadherin。在功能上,E-cadherin作為一種腫瘤抑制基因,在調節細胞極性、分化、遷移和干細胞樣特性方面發揮多種作用。在細胞極性的情況下,E-cadherin與相鄰細胞結合,形成細胞間復合物,形成上皮屏障。EMT過程中丟失的關鍵上皮標志物包括E-cadherin、Mucin-1、細胞角蛋白。相反,在此過程中獲得的標志物包括N-cadherin、平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白和Vimentin,它們共同構成了關鍵的間充質標志物[13]。本研究結果顯示,用DHA處理A549和H3255細胞后,DHA明顯抑制了NSCLC細胞的侵襲能力,并且E-cadherin的mRNA和蛋白水平表達增強,N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達水平受到明顯抑制。因此,本研究證實,DHA可通過抑制EMT,進而抑制A549和H3255細胞的遷移和侵襲能力。

VM是最近在許多惡性腫瘤中發現的血管生成過程,不同于傳統的涉及血管內皮的血管生成過程。腫瘤細胞沿著現有或新誘導的血管遷移,為腫瘤生長和轉移提供能量。近年來,一些針對血管生成的臨床治療并不令人滿意,這可能是由于VM的激活所致。研究[14]認為,EMT和VM息息相關,EMT導致了VM的發生,在EMT過程中,一些間充質細胞標記物被上調,包括VE-cadherin、纖連蛋白、鈣黏蛋白2和Vimentin。而VE-cadherin 是一個生物標志物,在VM的形成過程中起著至關重要的作用[15]。本研究通過三維細胞培養技術觀察對照組和DHA組VM的形成,發現DHA抑制了血管樣結構的形成,并且DHA組VE-cadherin的mRNA和蛋白表達水平受到明顯抑制,證實了DHA抑制VM,但是否是通過抑制EMT來抑制VM,尚未證實。

綜上所述,本研究于體外證實了DHA抑制NSCLC的A549和H3255細胞的增殖、遷移、侵襲能力,誘導E-cadherin mRNA和蛋白表達及抑制N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白水平表達,抑制EMT效應;DHA還抑制VM的形成,下調VE-Cadherin mRNA和蛋白水平表達。但DHA是否通過抑制EMT效應進而抑制VM還有待進一步研究。