μ阿片受體在大鼠結腸平滑肌細胞中的表達

任曉潔 ,賈冰涵 ,李金釗 ,羅慧娟 ,李 瑗 ,李軍平

阿片類制劑如嗎啡是臨床常用的強效鎮痛劑,在緩解慢性頑固性疼痛,比如癌性痛等方面有非常好的效果[1]。研究[2]證實,嗎啡主要經μ阿片受體(μ-opioid receptor,MOR)介導發揮鎮痛效應。MOR是阿片類受體的一種,相較于其它阿片類受體,MOR在胃腸道的分布尤為豐富,在結腸分布更為密集[3]。在結腸內,MOR廣泛分布于腸神經細胞中[4-5],但在胃腸道平滑肌細胞的分布未見報道。該課題組前期研究[6]發現,給體外培養的平滑肌細胞施加內嗎啡肽2(endomorphin-2,EM2)后,可直接誘發平滑肌細胞的功能活動。EM2是MOR的高親和性內源性配體,在體內與MOR的分布基本相似。該研究擬通過培養大鼠結腸原代平滑肌細胞,利用免疫熒光組織化學雙重標記、Western blot和鈣成像等技術,觀察MOR和EM2在結腸平滑肌細胞內的表達特性,為探索MOR在結腸平滑肌細胞內作用機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取體質量100～120 g的SD雄性大鼠50只,SPF級,由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2實驗試劑 澳洲胎牛血清、DMEM高糖、無HEPES培養基(美國賽默飛世爾科技有限公司);雅酶配膠試劑盒(上海雅酶生物醫藥科技有限公司);全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司);蛋白含量檢測試劑盒、超靈敏化學發光檢測試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司);胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司);膠原酶Ⅱ(上海西格瑪奧德里齊貿易有限公司);PBS磷酸鹽緩沖液(美國HyClone公司);4%多聚甲醛(北京博奧拓達科技有限公司);蘇木精-伊紅染色(北京九州柏林生物科技有限公司);鈣離子熒光探針Fluo-4,AM(北京索萊寶科技有限公司)。一抗:兔抗MOR多克隆抗體(美國Abcam公司),兔抗鈣調蛋白(calmodulin,CaM)單克隆抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司),小鼠抗α-SMA單克隆抗體、兔抗EM2單克隆抗體、豚鼠抗MOR多克隆抗體(美國Abcam公司);熒光素標記二抗:Alex488標記山羊抗兔血清、Alex594標記山羊抗兔血清、Alex488標記山羊抗小鼠血清、Alex594標記山羊抗豚鼠血清(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠結腸原代平滑肌細胞的分離、培養和鑒定

1.2.1.1結腸平滑肌細胞的提取與分離 大鼠禁食不禁水24 h,離斷頸椎處死,用75%乙醇消毒。無菌條件下剖開腹部,快速截取肛門上2 cm遠段結腸。用生理鹽水反復灌腸,沖洗結腸內部殘余糞便。沿著腸系膜對側剪開,將其轉移到含青霉素100 U/ml和鏈霉素0.1 mg/ml的Krebs液中。浸泡15 min后,移入超凈臺,鏡下撕去漿膜,去除黏膜層及黏膜下層,即為大鼠結腸平滑肌層。用顯微剪將組織層剪至 1～2 mm3體積后,將組織碎塊加入10 ml胰酶消化液中,37 ℃恒溫震蕩,轉速90次/min,消化30 min,在顯微鏡下觀察發現,組織塊周圍有散在的圓形透亮的細胞分布,量取12 ml完全培養液終止消化,吸除胰酶消化液和培養液。加入10 ml膠原酶Ⅱ消化液,37 ℃震蕩120 min,吹打分散細胞,加入10 ml完全培養液終止消化。過100目細胞篩網,收集細胞懸液,將其轉移至15 ml離心管中,在離心機中設定轉速參數為1 000 r/min,離心5 min。棄掉殘存消化液和培養液,繼續加入完全培養液,緩慢吹打,1 000 r/min離心5 min,重懸細胞。用細胞計數儀計數,按5×105個/ml種植到25 cm2培養瓶中,將培養瓶放置于培養箱中,在37 ℃培養24 h后,細胞貼壁生長,待生長到致密單層后傳代。

1.2.1.2結腸平滑肌細胞培養 大鼠結腸平滑肌細胞原代培養7 d后,覆蓋培養瓶底90%以上。棄掉原培養液,用PBS液沖洗3次,加入1 ml胰酶消化液,在37 ℃培養箱中消化2 min。鏡下觀察,變圓形的細胞占比為90%,繼續加入2 ml完全培養基,終止消化,反復吹打細胞混勻,將其轉移到15 ml離心管內。在離心機中設定轉速參數為1 000 r/min離心5 min,棄去殘存消化液和培養基,用細胞計數儀計數,根據細胞的數量按照1 ∶2或1 ∶3傳代,吹打混勻,加入培養瓶內,鏡下觀察細胞呈圓形,胞質透亮,轉移到培養箱中繼續培養,胰酶消化后平滑肌細胞可傳5代,傳代結腸平滑肌細胞貼壁早、生長快。

1.2.1.3結腸平滑肌細胞鑒定 提取第2次傳代的結腸平滑肌細胞,按照1×105個/ml密度接種于24孔細胞培養板,細胞長到95%以上,利用免疫熒光組織化學技術標記細胞內α-SMA進行細胞鑒定。棄掉原培養基,用PBS(4 ℃)清洗細胞3次,加入4%多聚甲醛固定,每孔加入500 μl,常溫下固定30 min。繼續用PBS(4 ℃)清洗3次,每個孔內加入100 μl 0.5% Triton X-100,PBS漂洗3次,每孔加入100 μl 5%羊血清封閉30 min后,加入一抗:小鼠抗α-SMA單克隆抗體(1 ∶200),常溫孵育1 h后置于4 ℃過夜孵育。復溫20 min后,用PBS(4 ℃)洗3次,每次10 min。加入對應的熒光素標記的二抗:Alex594標記山羊抗小鼠血清(1 ∶200),室溫避光條件下靜置1 h后,用PBS(4 ℃)洗3次,每次10 min。用DAPI染核封片,用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2HE染色 結腸平滑肌細胞按照1×105個/ml密度接種于24孔細胞培養板,待細胞長到致密單層后進行HE染色。棄掉原培養基,用PBS(4 ℃)洗3次,每次5 min。加4%多聚甲醛500 μl,室溫下固定30 min后,移出細胞間,用PBS(4 ℃)洗3次。加入不同濃度梯度乙醇,無水乙醇Ⅰ 5 min,無水乙醇Ⅱ 5 min,95%乙醇5 min,90%乙醇5 min,80%乙醇5 min,70%乙醇5 min,流水沖洗2 min。蘇木精染色5 min,在流水下沖洗5 min,轉移到鹽酸乙醇中分化3 s,繼續流水沖洗15 min,用伊紅染色5 min。脫水:70%乙醇3 s,80%乙醇3 s,90%乙醇3 s,95%乙醇5 min,無水100%乙醇Ⅰ 5 min,無水100%乙醇Ⅱ 5 min。透明:分別加入1 ml二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各5 min,用中性樹脂封片后在普通光鏡下觀察。

1.2.3免疫熒光組織化學雙重標記 取第2次傳代細胞,按照1×105個/ml密度接種于24孔細胞培養板,細胞在載玻片上生長融合到95%以上進行實驗。棄掉原培養基,用PBS(4 ℃)洗3次,每孔加入500 μl 4%多聚甲醛,室溫下固定30 min。用PBS(4 ℃)洗3次,每個孔內加入100 μl 0.5%Triton X-100孵育10 min,PBS洗3次,每次10 min。用5%羊血清封閉30 min后,分別加入對應的一抗:兔抗MOR多克隆抗體(1 ∶200)和小鼠抗α-SMA單克隆抗體(1 ∶200)、兔抗EM2多克隆抗體(1 ∶100)和小鼠抗α-SMA單克隆抗體(1 ∶200)、兔抗CaM單克隆抗體(1 ∶200)和豚鼠抗MOR多克隆抗體(1 ∶200),室溫孵育1 h后,置于4 ℃孵育48 h。復溫20 min后,用PBS(4 ℃)洗3次,每次10 min,分別加入熒光素標記的二抗:Alex594標記山羊抗兔血清(1 ∶200)和Alex488標記山羊抗鼠血清(1 ∶200)、Alex594標記山羊抗豚鼠血清(1 ∶200)和Alex488標記山羊抗兔血清(1 ∶200)。室溫孵育1 h后,用PBS(4 ℃)洗3次,每次10 min,用DAPI染核封片,5 min后用熒光顯微鏡觀察并采集圖片。

1.2.4Western blot檢測 取第2次傳代的大鼠結腸平滑肌細胞,棄掉培養基,用PBS清洗細胞3次,施加干預措施,將結腸平滑肌細胞分為三組,正常對照組(CON)、乙酰膽堿組(ACh,濃度1×10-3mol/L)、內嗎啡肽-2組(EM2,濃度2 μmol/L),分別孵育結腸平滑肌細胞1、5、10、15 min后提取蛋白。按Lysis buffer 1 ml,磷酸酶抑制劑10 μl,蛋白酶抑制劑1 μl,PMSF 5 μl配置細胞裂解液,搖勻置于冰面上,用無菌細胞刮將細胞推向培養瓶的一側,于冰上裂解30 min。不斷搖晃培養瓶使細胞充分裂解,將細胞碎片和裂解液移置1.5 ml離心管內,于4 ℃下12 000 r/min離心5 min。將離心后的上清轉移到0.5 ml離心管中于-80 ℃保存。用二喹啉甲酸(BCA)法測量蛋白質濃度,分別取樣品蛋白、純水和5×蛋白上樣緩沖液(5×loading buffer)配平,分裝保存于-80 ℃,避免反復凍融。各樣品蛋白取30 μg上樣,80 V電壓電泳30 min后,切換至120 V電壓繼續進行,200 mA恒流濕轉,MOR蛋白(60 min)、EM2蛋白(20 min)、CaM(30 min)、GAPDH(40 min)分別轉印到PVDF膜上。5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h后,將含有EM2蛋白、MOR蛋白、CaM蛋白、GAPDH蛋白的PVDF膜浸入到對應的兔抗EM2單克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗MOR多克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗CaM單克隆抗體(1 ∶1 000)和小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1 ∶2 000),室溫孵育1 h后置于4 ℃過夜。用含0.1%吐溫20的Tris緩沖鹽溶液(tris buffered saline with tween 20,TBST)洗膜3次,每次10 min。加對應的HRP-山羊抗兔IgG(1 ∶3 000)和HRP-山羊抗小鼠IgG(1 ∶3 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,超靈敏化學發光試劑使蛋白條帶可視化,通過化學圖像系統(Amersham Iamge 600)曝光采集圖像。

1.2.5鈣離子成像檢測 取第2次傳代的大鼠結腸平滑肌細胞,棄去培養液,用HBSS液(不含鈣鎂,不含酚紅)沖洗細胞3次, 加入鈣離子熒光探針Fluo-4,AM 1 μl,pluronic F-127 1 μl ,在37 ℃的培養箱中孵育30 min后,在熒光顯微鏡下觀察負載情況。將孵育的細胞置于顯微鏡下,打開加藥通道,第一通道加入5 ml ACh(1×10-3mol/L),第二通道加入5 ml EM2(2 μmol/L),第三通道先加入5 ml ACh(1×10-3mol/L)觀察200 s后接著加入5 ml EM2(2 μmol/L),打開氮氣閥門,排空管內空氣,選擇中等密度的細胞層,在激光顯微鏡下進行持續動態掃描,鈣離子與Fluo-4,AM結合在488 nm的波長和526 nm的發射波長處被激發,通過計算機記錄鈣離子熒光強度的變化。實驗結果以給藥前后單個細胞的熒光強度變化表示細胞內游離鈣離子濃度的相對變化,實驗結果用△F/F0表示,△F=F-F0,F:鈣離子熒光強度值;F0:基線水平。

1.3 統計學處理采用SPSS 22.0軟件進行數據分析,Western blot實驗結果使用單因素方差分析,鈣成像結果使用配對樣本t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸平滑肌細胞的培養與鑒定

2.1.1結腸平滑肌細胞的培養 光鏡下觀察可見,結腸平滑肌細胞在未貼壁前,細胞大小不一,生長密度不均;培養24 h后細胞開始貼壁生長,細胞長度各異,外形多樣,多為長梭形或多邊形,呈放射性生長,胞質透明(圖1A～C)。7 d后可見平滑肌細胞呈多層重疊或單層,高低起伏,胞質豐富,有分枝狀突起(圖1D～F)。14 d后結腸平滑肌細胞密度增大,融合成片,細胞突起相互接觸交錯(圖1G～I)。

圖1 培養的大鼠結腸平滑肌細胞

2.1.2結腸平滑肌細胞的鑒定 熒光顯微鏡下觀察可見大量α-SMA標記陽性細胞,α-SMA標記陽性細胞外形呈條索狀,大小不一。α-SMA標記的陽性細胞占培養細胞總數的95%以上(圖2)。

圖2 大鼠結腸平滑肌細胞免疫熒光鑒定 ×10

2.2 HE染色光鏡下觀察可見,培養24 h后細胞形態大小不一,多呈長梭形,細胞核嗜堿性呈藍色,胞質嗜酸性呈粉紅色(圖3 A～C)。7 d后平滑肌細胞胞質豐富,呈粉紅色,染色較淺,核位于細胞中央,呈長橢圓形,染色較深(圖3 D～F)。14 d后結腸平滑肌細胞密度增大,相互交錯,密集排列,細胞核卵圓形居中呈藍色,胞質呈粉紅色(圖3G～I)。

圖3 大鼠結腸平滑肌細胞HE染色

2.3 MOR和EM2分別與α-SMA在結腸平滑肌細胞的分布特點熒光顯微鏡下觀察可見,在平滑肌細胞內有大量MOR的陽性標記物分布,細胞外形呈長梭形,大小不一,所有MOR標記陽性細胞均呈α-SMA標記陽性,說明MOR和α-SMA在平滑肌細胞有共存(圖4A～D)。在平滑肌細胞內也可見EM2的陽性標記物,EM2陽性細胞呈長梭形或三角形,大小不一,所有EM2標記陽性細胞均呈α-SMA標記陽性,說明EM2和α-SMA在平滑肌細胞內也有共存(圖4 E～H)。

圖4 免疫熒光組織化學雙重標記 ×20

2.4 觀察MOR與CaM在結腸平滑肌細胞的分布特點熒光顯微鏡下觀察可見,MOR的陽性標記物在平滑肌細胞有大量分布,細胞外形呈長梭形,大小不一(圖5A),在MOR陽性的平滑肌細胞內也可見CaM的陽性標記物,CaM陽性細胞呈長梭形或三角形,大小不一(圖5B),說明MOR和CaM在平滑肌細胞有共存(圖5C)。

圖5 免疫熒光組織化學雙重標記 ×20

2.5 EM2和MOR在結腸平滑肌細中的表達Western blot結果顯示,在結腸平滑肌細胞內有EM2和MOR的表達(圖6)。

圖6 Western blot技術檢測EM2和MOR在結腸平滑肌細胞的表達

2.6 施加不同干預措施后,不同時間點結腸平滑肌細胞內CaM蛋白的表達施加ACh(1×10-3mol/L)或EM2(2 μmol/L)后1、5、15 min,與CON組比較,ACh組和EM2組CaM蛋白表達無變化(P>0.05)。施加ACh(1×10-3mol/L)或EM2(2 μmol/L)10 min時,與CON組比較,ACh組CaM蛋白表達升高(P=0.037 2),但EM2組CaM蛋白表達下降(P=0.018 4),見圖7。

圖7 Western blot技術檢測不同時間點結腸平滑肌細胞內CaM蛋白的表達

2.7 施加不同干預措施后,平滑肌細胞內鈣離子濃度的變化施加ACh(1×10-3mol/L),與給藥前(Base)比較,400 s后平滑肌細胞內鈣離子熒光強度增強(t=3.101,P=0.021 1),700 s時達到高峰(圖8A、B)。施加EM2(2 μmol/L)后,與給藥前(Base)比較,400 s后平滑肌細胞內鈣離子熒光強度降低(t=2.187,P=0.030 5,圖8C、D)。施加ACh(1×10-3mol/L)后,與給藥前(Base)比較,平滑肌細胞內鈣離子熒光強度增強(P=0.028 6),觀察200 s后接著施加EM2(2 μmol/L),與單純施加ACh(1×10-3mol/L)比較,平滑肌細胞內鈣離子熒光強度下降(F=24.20,P=0.000 2,圖8E、F)。

圖8 鈣成像技術檢測平滑肌細胞內鈣離子濃度的變化

3 討論

原代結腸平滑肌細胞是從大鼠遠端結腸組織提取和分離后獲得的,遺傳特征與體內細胞非常相似,適合于細胞形態、功能和分化方面的研究,排除了機體內其他因素的干擾[7]。α-SMA存在于胃腸道肌層等各種肌組織內,構成了平滑肌細胞的骨架,參與平滑肌細胞許多重要的功能活動,包括平滑肌細胞的舒縮活動[8]。因此,本研究通過標記α-SMA用于鑒定結腸平滑肌細胞是可行的。

課題組前期研究[9]發現,EM2在結腸神經細胞也有大量分布。然而,MOR和EM2在結腸平滑肌細胞的分布未見文獻報道。本研究免疫熒光組織化學結果顯示,在原代培養的平滑肌細胞內有MOR和EM2的分布,且MOR與CaM在培養的平滑肌細胞內也有共存。

CaM是平滑肌細胞內的鈣離子受體蛋白,其本身沒有活性,但對鈣離子有高度依賴性。鈣離子與CaM結合形成Ca2+-CaM復合物,Ca2+-CaM復合物是一種重要的興奮-收縮耦合調節因子[10],通過平滑肌細胞內信號傳導通路,調控平滑肌收縮和舒張[11],當胞內鈣離子濃度升高時,鈣離子與CaM形成的Ca2+-CaM復合物作用于胞質中的肌球蛋白輕鏈激酶,使肌球蛋白輕鏈激酶活化,從而觸發平滑肌收縮。因此,CaM在鈣離子依賴性信號轉導過程中起到關鍵作用[12]。本研究結果顯示,在施加干預措施ACh或EM2大約10 min后平滑肌細胞反應明顯。施加ACh后平滑肌細胞內的CaM表達增加,但是施加EM2后CaM的表達下降。有文獻[13]報道,EM2和嗎啡在緩解癌性痛方面,其止痛時效完全不同,嗎啡起效時間大約在40～100 min,而EM2的鎮痛作用起效快、時間短,在10 min時藥效最強,這與本研究結果相似。CaM的活性高度依賴平滑肌細胞內鈣離子的濃度。說明EM2經MOR介導后可能對鈣離子的釋放有抑制作用。

有文獻[14]報道,平滑肌細胞的收縮活動主要受胞質內鈣離子的調控。而胃腸道平滑肌的舒縮主要與鈣離子依賴途徑相關。在鈣離子依賴途徑中胞內鈣離子來源主要有兩方面:外鈣內流和內鈣池釋放。外鈣內流是通過電壓依賴型和受體依賴型等膜通道[15],引起細胞外鈣離子進入細胞內。內鈣池釋放是指肌漿網中鈣離子通過釋放和再攝取對胞內鈣離子濃度進行調節[16]。ACh可通過平滑肌細胞表面的毒蕈堿受體M3介導,激活平滑肌細胞膜電壓依賴性鈣通道和受體操縱性鈣通道,促使鈣離子內流,同時也可通過耦聯細胞膜上的G蛋白,激活磷脂酶C,該酶可水解4,5-二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸肌醇和二酰甘油,三磷酸肌醇作為第二信使,作用于肌漿網膜上的三磷酸肌醇受體,導致肌漿網儲存的鈣離子釋放,使細胞內鈣離子濃度短暫升高,Ca2+-CaM復合物增加,激活肌球蛋白輕鏈激酶,引起胃腸道平滑肌細胞收縮[17]。

有文獻[18]報道,在體外培養的細胞中通過施加ACh,在240 s細胞內鈣離子濃度達到最大值,在本研究鈣離子成像實驗中,為排除細胞外鈣內流對平滑肌細胞功能的影響,特意使用了無鈣離子緩沖液。單純施加ACh后,鈣離子濃度在700 s內升高達到最大值,與文獻報道基本一致。但單純施加EM2后,鈣離子濃度明顯下降。施加ACh后觀察200 s,接著施加EM2,EM2明顯抑制了ACh的作用。據此推測,EM2經結腸平滑肌細胞表面的MOR介導后,可能對細胞內肌漿網鈣離子的釋放有調節作用。

綜上所述,平滑肌細胞內EM2或腸神經細胞分泌的EM2,經平滑肌細胞表面的MOR介導后,可能通過調節胞內肌漿網鈣離子釋放,反饋性的參與到平滑肌細胞的收縮抑制過程中,并且此過程也可能受到腸神經系統的正向調控。對于平滑肌細胞表面的MOR在平滑肌細胞功能活動中的具體作用機制和功能,尚需進一步研究。