牙齦卟啉單胞菌感染食管癌細胞誘導M2型巨噬細胞極化促進食管癌進展

郭靜宜,原 翔,石林林,張秀森,孔金玉,張頂彧,高社干

食管癌(esophageal cancer,EC)是惡性程度較高的消化系統腫瘤[1],常見組織學類型為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)[2]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivallis,Pg)是一種革蘭陰性厭氧菌,可以通過其毒力因子引起宿主免疫功能異常,成為腫瘤潛在危險因素[3]。本課題組前期研究[4]表明,Pg與ESCC的發生發展具有正相關性。巨噬細胞是機體固有免疫的重要組成部分之一,可塑性極強,在腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)中不同因素影響下會分化為不同亞群,具備不同的功能,參與調控腫瘤組織免疫反應。巨噬細胞主要分兩種表型:M1抗腫瘤型和M2促腫瘤型[5]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages,TAMs)是腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞,是TME中最豐富的細胞之一[6]。現有研究多為TAMs如何調控癌癥的侵襲遷移,對腫瘤細胞如何影響巨噬細胞極化的機制研究尚未明確。該研究首次通過探尋Pg感染ESCC細胞對巨噬細胞極化及其功能變化的影響,探討ESCC發病機制,為ESCC病因學提供數據支持,為免疫治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞與細菌 人ESCC細胞株KYSE140、KYSE150購自中國科學院細胞庫;人單核細胞白血病細胞株(THP-1)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;標準Pg菌株來源于ATCC細胞庫。

1.1.2主要試劑 PMA購自美國Sigma公司;白細胞介素(interleukin,IL)-4購自美國PeproTech公司。RPMI-1640培養基、FBS、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司;青-鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司;β-巰基乙醇購自武漢普諾賽生命科技有限公司;CD11b-FITC購自美國Thermo Fisher公司、CD68-BV421購自美國BD公司、CD206-PE購自美國Biolegend公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成。Human IL-6 ELISA Kit、Human IL-10 ELISA Kit購自杭州聯科生物技術股份有限公司。

1.1.3主要儀器設備 CO2培養箱(美國Thermo Fisher公司)、厭氧培養箱(美國Shellab公司)、激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)、流式細胞儀(美國Cytek公司)、多功能酶標儀(美國Biotek公司)、熒光定量PCR儀(美國Bio Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與實驗分組 將不同分化程度的ESCC細胞系KYSE140和KYSE150采用完全培養基(RPMI-1640+10% FBS+1%青-鏈霉素),37 ℃、5% CO2培養箱中培養,按1 ∶4比例傳代。THP-1細胞采用完全培養基(RPMI-1640+10% FBS+1%青-鏈霉素+0.05 mmol/L β-巰基乙醇)37℃、5% CO2培養箱培養。2～3 d換液,4～5 d按1 ∶2～1 ∶4比例傳代,取對數生長期細胞進行后續實驗。實驗分組:① M0組:將THP-1細胞以4×105個/孔接種于6孔板,加入50 ng/ml PMA培養48 h,細胞由懸浮狀態變為貼壁狀態,即為M0巨噬細胞;② M2組:M0細胞中加入20 ng/ml IL-4培養3 d,即為M2型巨噬細胞;③ KYSE150CM組:將KYSE150細胞培養3 d,收集細胞培養上清液,1 000 r/min離心5 min去除沉淀獲得KYSE150CM;④ KYSE150(Pg+)CM組:Pg感染KYSE150細胞3 d,收集細胞培養上清液,1 000 r/min離心5 min去除沉淀獲得KYSE150(Pg+)CM;⑤ TAMKYSE150組:取50% KYSE150CM加上50%新鮮完全培養基培養M0細胞,即為TAMKYSE150;⑥ TAMKYSE150+(Pg)組:取50% KYSE150(Pg+)CM加上50%新鮮完全培養基培養M0細胞,即為TAMKYSE150(Pg+);⑦ M0-CM組:將THP-1誘導而來的M0細胞培養3 d,收集培養上清液,1 000 r/min離心5 min去除沉淀獲得M0-CM;⑧ TAMKYSE150-CM組:采用KYSE150CM共培養巨噬細胞后,去除TAMs培養上清液,更換為新鮮完全培養基,培養3 d收集上清液,1 000 r/min離心5 min去除沉淀獲得TAMKYSE150-CM;⑨ TAMKYSE150(Pg+)-CM組:采用KYSE150(Pg+)CM共培養巨噬細胞后,去除TAMs培養上清液,更換為新鮮完全培養基,培養3 d收集上清液,1 000 r/min離心5 min去除沉淀獲得TAMKYSE150(Pg+)-CM。

1.2.2菌株培養與感染 標準菌株Pg采用BHI液體培養基于85% N2、5% CO2、10% H2、37 ℃厭氧培養箱中培養。細菌復蘇后傳代至第2或第3代處于對數生長期時,吸取300 μl菌液于石英比色皿中,利用紫外分光光度計,檢測600 nm下的吸光度,取600 nm下吸光度值在1～2之間的細菌進行梯度傳代或感染細胞。細菌感染:根據600 nm下吸光度值計算菌液濃度為1×109CFU/ml 時對應的菌液體積,吸取相應體積菌液,4 ℃,12 000 r/min離心10 min,去除培養基,加入1 ml 無菌PBS重懸,獲得1×109CFU/ml Pg菌液。根據感染復數(multiplicity of infection,MOI)=20,即細菌與細胞比例為20 ∶1,吸取相應體積菌液加入細胞培養基,進行細胞感染。

1.2.3ELISA實驗 按照說明書步驟準備好檢測細胞培養上清液,在包被好抗體的板孔中加入100 μl標準品工作液或樣本,50 μl抗體,室溫孵育2 h;洗板6次,加入100 μl辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素,室溫孵育45 min;洗板6次;每孔加入100 μl顯色底物溶液,室溫孵育10 min左右;每孔加入100 μl終止液;立即在450 nm波長檢測吸光度值。

1.2.4細胞免疫熒光 將不同條件下處理過的巨噬細胞消化重懸計數,細胞密度按1×103個/孔接種于玻璃底共聚焦小皿,放入培養箱孵育24 h以上,4%多聚甲醛室溫固定1 h,0.2% TritonX-100透化5～10 min, 5% BSA封閉1 h,1% BSA稀釋抗體,一抗CD68(1 ∶50)、CD206(1 ∶100)4 ℃過夜,PBS洗滌3次,熒光二抗室溫避光孵育30 min,PBS洗滌3次,DAPI核染色,激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.5qRT-PCR實驗 使用TRIzol分別提取Pg感染與未感染的KYSE150細胞、Pg感染與未感染的KYSE140細胞、M0細胞、M2細胞、與KYSE150共培養的TAMs、與Pg陽性KYSE150細胞共培養的TAMs總RNA,測量RNA濃度后將RNA逆轉錄為cDNA。采用qPCR方法檢測CD206、CD163等mRNA相對表達量,每組樣本重復3次。IL-6上游引物5′-CCCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTA-3′,下游引物5′-GTCGAGGATGTACCGAATTTGTTTG-3′; IL-10上游引物5′-GTGAAGACTTTCTTTCAAACAAAG-3′,下游引物5′-CTGCTCCACTGCCTTGCTCTTATT-3′;CD163上游引物5′-GCAAACTCAGAATGGTGCTAC-TTGA-3′,下游引物5′-CAGTAATGGTGAAGGGACTCAGGTT-3′;CD206 上游引物5′-TTGAATACTGTGGTGAGCTGAAAGG-3′,下游引物5′-GGCAAATCCAG-TTGTTAAGGTGTTC-3′。95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,39個循環。按2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平。

1.2.6流式細胞術 將M0細胞、M2細胞、與KYSE150共培養的TAMs、與Pg陽性感染的KYSE150細胞共培養的TAMs分別消化下來,PBS洗滌2遍,2 000 r/min離心5 min去上清液,200 μl PBS重懸細胞轉移至流式管,一抗CD11b-FITC、CD68-BV421、CD206-PE染色,4 ℃避光孵育30 min,加300 μl PBS洗滌未結合染料,離心去上清液后加入300 μl PBS重懸細胞上機檢測。

1.2.7CCK-8實驗 將KYSE150細胞按1×103個/孔接種于96孔板,每組設置3個復孔,加上與Pg感染或未感染的KYSE150細胞共培養的TAMs條件培養基以及對照組含血清培養基作為趨化條件,分別在0、12、24、36、48 h每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃培養箱孵育1 h,使用多功能酶標儀在450 nm處檢測吸光度值,繪制細胞生長曲線。

1.2.8克隆形成實驗 將KYSE150細胞按1×103個/孔接種于6孔板中,待細胞貼壁,將培養基更換為與Pg感染或未感染的KYSE150細胞共培養的TAMs CM,37 ℃培養箱培養2周,一周2次換液,當細胞形成肉眼可見的克隆時,吸去培養基,PBS洗滌3次,4%多聚甲醛固定,結晶紫染色后,PBS洗滌,拍照使用Image J計數細胞克隆數。

1.2.9劃痕實驗 將KYSE150細胞按4×105個/孔接種于底部畫好橫線的6孔板中,待細胞長至80%劃痕,PBS洗滌漂浮細胞,加上與Pg感染或未感染的KYSE150細胞共培養的TAMs CM,顯微鏡拍照0、24 h劃痕愈合情況,使用Image J軟件測量不同時間點劃痕面積,進行統計。

1.2.10Transwell實驗 將饑餓過的KYSE150細胞重懸于無血清培養基接種于Transwell小室上室,加上與Pg感染或未感染的KYSE150細胞共培養的TAMs CM為趨化條件,37 ℃培養箱孵育24～48 h終止。吸去培養基,用棉簽去除未侵襲入膜的細胞,PBS洗滌小室,4%多聚甲醛固定,結晶紫染色后,光學顯微鏡下拍照計數細胞量。

2 結果

2.1 IL-6、IL-10在Pg感染的食管癌細胞中的表達為觀察Pg感染對ESCC細胞的影響,通過ELISA方法檢測細胞上清液中IL-6、IL-10的濃度變化,利用qRT-PCR方法檢測感染與未感染Pg的ESCC細胞IL-6、IL-10 mRNA轉錄水平的變化。qRT-PCR結果顯示:Pg感染ESCC細胞系后,KYSE140細胞系IL-6 mRNA表達較未感染組升高[(2.46±0.10)vs(1.69±0.04),P<0.01]、KYSE150細胞系IL-6 mRNA表達較未感染組升高[(3.57±0.04)vs(1.29±0.06),P<0.001]、 KYSE140細胞系IL-10 mRNA表達較未感染組升高[(3.34±0.08)vs(2.53±0.05),P<0.01]、KYSE150細胞系IL-10 mRNA表達較未感染組升高[(2.57±0.04)vs(1.29±0.06),P<0.01](圖1A)。ELISA結果顯示:Pg感染ESCC細胞系后,KYSE140細胞系分泌的細胞因子IL-6水平較未感染組升高[(1 650.07±31.86)pg/mlvs(1 150.81±13.46)pg/ml,P<0.001]、KYSE150細胞系分泌細胞因子IL-6水平較未感染組升高[(3 001.03±59.81)pg/mlvs(1 313.80±77.85)pg/ml,P<0.001]、KYSE140細胞系分泌的細胞因子IL-10水平較未感染組升高[(2 646.70±16.33)pg/mlvs(1 111.23±32.14)pg/ml,P<0.000 1]、 KYSE150細胞系分泌的細胞因子IL-10水平較未感染組升高[(2 926.56±57.68)pg/mlvs(1 393.58±35.07)pg/ml,P<0.001](圖1B)。綜上,Pg感染ESCC細胞系IL-6、IL-10 mRNA轉錄水平及ESCC細胞分泌的細胞因子IL-6、IL-10水平均有所升高,差異有統計學意義。

圖1 Pg感染對ESCC細胞IL-6、IL-10表達的影響

2.2 Pg對ESCC細胞調控M2型TAMs極化的影響

2.2.1流式細胞術檢測與Pg感染的ESCC細胞共培養的TAMs表面標記物變化 為觀察Pg感染與未感染ESCC細胞CM對TAMs極化的影響,采用流式細胞術方法檢測M0細胞、M2細胞、與KYSE150共培養的TAMs細胞及與Pg感染的KYSE150共培養的TAMs細胞表面M2型巨噬細胞標記物CD206的表達水平。流式結果顯示:與KYSE150CM組比較,KYSE150(Pg+)CM組CD206+TAMs比例升高,差異有統計學意義[(20.90±1.25)%vs(60.97±0.81)%,P<0.000 1]。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測與Pg感染的ESCC細胞共培養的TAMs CD206比例變化

2.2.2qRT-PCR檢測Pg感染對共培養TAMs表面標記物表達水平的影響 為觀察Pg感染與未感染ESCC細胞CM對TAMs極化的影響,分別提取M0細胞、M2細胞、與KYSE150共培養的TAMs細胞及與Pg感染的KYSE150共培養的TAMs細胞總RNA,通過qRT-PCR檢測各分組轉錄因子的表達水平。qRT-PCR結果顯示:Pg感染ESCC細胞后,KYSE150(Pg+)CM組TAMs CD206 mRNA表達量比KYSE150CM組CD206 mRNA表達量高[(5.10±0.42)vs(1.60±0.45),P<0.001],KYSE150(Pg+)CM組TAMs CD163 mRNA表達量比KYSE150CM組TAMs CD163 mRNA表達量高 [(6.30±0.50)vs(2.35±0.12),P<0.001],差異有統計學意義。見圖3。

圖3 qRT-PCR檢測與Pg感染的KYSE150細胞共培養的TAMs CD206 mRNA、CD163 mRNA表達水平變化

2.2.3免疫細胞熒光檢測與Pg感染的ESCC細胞共培養的巨噬細胞表面標記物變化 為觀察Pg感染與未感染ESCC細胞CM對TAMs極化的影響,將M0細胞、M2細胞、與KYSE150共培養的TAMs細胞及與Pg感染的KYSE150共培養的TAMs細胞,消化重懸接種于共聚焦小皿,激光共聚焦顯微鏡觀察。結果顯示:與KYSE150CM組比較,M0+KYSE150(Pg+)CM組,M2型巨噬細胞表面標記物CD206與巨噬細胞表面標志物CD68共定位增加,即M2型巨噬細胞表面標志物CD206表達升高。見圖4。

圖4 免疫細胞熒光檢測與Pg感染的KYSE150細胞共培養的TAMs CD206表達水平變化 ×400

2.3 Pg感染ESCC細胞細胞對共培養TAMs分泌IL-6、IL-10水平的影響采用ELISA方法檢測與KYSE150細胞或Pg感染的KYSE150細胞共培養的TAMs分泌細胞因子水平的變化。結果顯示:TAMKYSE150組TAMs分泌IL-6水平較M0組升高[(662.78±59.15)pg/mlvs(232.85±19.10)pg/ml,P<0.01],TAMKYSE150(Pg+)組分泌IL-6水平較TAMKYSE150組進一步升高[(1 183.11±44.12)pg/mlvs(662.78±59.15)pg/ml ,P<0.01];TAMKYSE150組TAMs分泌IL-10水平較M0組升高[(419.61±12.63)pg/mlvs(175.72±6.70)pg/ml,P<0.001],TAMKYSE150(Pg+)組分泌IL-10水平較TAMKYSE150組進一步升高[(1 163.64±35.07)pg/mlvs(419.61±12.63)pg/ml,P<0.01]。見圖5。

圖5 ELISA法檢測Pg感染ESCC細胞對共培養TAMs分泌細胞因子水平的影響

2.4 Pg感染ESCC細胞調控M2型TAMs極化對ESCC細胞惡性增殖的影響為觀察與Pg感染的ESCC細胞共培養后TAMs對ESCC細胞增殖、遷移、侵襲能力變化,將ESCC細胞分為3組,對照組加入M0-CM培養,實驗組分別加入TAMKYSE150-CM,TAMKYSE150(Pg+)-CM培養后進行CCK-8、克隆形成實驗、劃痕實驗及Transwell實驗。CCK-8細胞增殖活性實驗結果顯示:與對照組M0-CM比較,TAMKYSE150-CM組促進ESCC細胞增殖能力增強,TAMKYSE150(Pg+)-CM組比TAMKYSE150-CM組促進ESCC細胞增殖能力進一步增強,差異有統計學意義(F=108.03,P<0.01),見圖6A。克隆形成實驗結果顯示:與對照組M0-CM比較,TAMKYSE150-CM組促進ESCC細胞增殖能力增強,TAMKYSE150(Pg+)-CM組比TAMKYSE150-CM組促進ESCC細胞增殖能力進一步增強,差異有統計學意義(F=610.18,P<0.05),見圖6B。

圖6 與Pg感染的ESCC細胞共培養的TAMs對ESCC細胞增殖的影響

劃痕實驗結果顯示:與對照組M0-CM比較,TAMKYSE150-CM組促進ESCC細胞遷移能力增強,TAMKYSE150(Pg+)-CM組比TAMKYSE150-CM組促進ESCC細胞遷移能力進一步增強,差異有統計學意義(F=3 539.502,P<0.01)。見圖7。

圖7 與Pg感染的ESCC細胞共培養的TAMs對ESCC細胞遷移的影響 ×200

Transwell實驗結果顯示:與對照組M0-CM比較,TAMKYSE150-CM組促進ESCC細胞侵襲能力增強,TAMKYSE150(Pg+)-CM組比TAMKYSE150-CM組促進ESCC細胞侵襲能力進一步增強,差異有統計學意義(F=482.553,P<0.05)。見圖8。

圖8 與Pg感染的ESCC細胞共培養的TAMs對ESCC細胞侵襲的影響 ×200

3 討論

食管癌的發病機制復雜,其中微生物感染是主要高危因素之一。隨著細菌調控免疫作用被發現,其對腫瘤免疫影響相關機制的研究得到越來越多的關注[7]。以微生物為靶點的治療對食管癌的預防、早期發現與治療均具有重要意義。研究[8]發現,Pg感染ESCC細胞介導TME中T淋巴細胞免疫抑制,協助ESCC細胞免疫逃逸,從而維持自身定植。巨噬細胞是TME中數量最多的固有免疫細胞,可以有效清除病原菌。在此,本研究重點關注Pg感染ESCC細胞對TME中巨噬細胞的影響,進而研究Pg對微環境的改變及其對腫瘤進展的影響。

腫瘤發生發展過程中常常伴有感染引起的炎癥,腫瘤細胞分泌相關細胞因子作用于募集的免疫細胞,改變其細胞形態及功能,從而改變TME,進而助力腫瘤細胞逃避機體的免疫識別與攻擊[9]。在微環境中不同細胞因子和趨化因子的作用下,TAMs可極化為不同亞型,從而發揮不同的功能。在TME中,TAMs向M2型極化是一個多因素、多步驟的復雜病理過程[10]。病原菌可以通過調控宿主產生不同的細胞因子而間接調控巨噬細胞的極化狀態,從而抑制宿主免疫系統,使病原菌得以逃避宿主免疫系統的防御及殺傷。研究[11]發現結直腸癌細胞分泌的IL-4影響TAMs的M2極化。具核梭桿菌感染通過TLR4依賴性機制促進巨噬細胞向M2型極化[12]。本研究通過檢測Pg感染對ESCC細胞的影響,發現Pg感染促進ESCC細胞中IL-6、IL-10的分泌水平。為了進一步探究Pg感染ESCC細胞對TAMs調控作用,本研究建立Pg感染的ESCC細胞與TAMs共培養模型,證實與Pg感染ESCC細胞共培養的TAMs表面M2型標志物表達量升高,提示Pg可以促進ESCC細胞調控M2型TAMs極化。同時,Pg感染ESCC細胞促進共培養TAMs分泌IL-6、IL-10水平升高。

M2型TAMs通常被認為在腫瘤進展過程中抑制炎癥反應和促進腫瘤免疫逃逸[13]。本研究利用與Pg感染或未感染的ESCC細胞共培養的TAMs CM再去培養ESCC細胞,觀察其對腫瘤細胞功能變化的影響。實驗結果表明,被Pg感染的ESCC細胞極化的TAMs,可以進一步促進ESCC細胞的增殖,遷移及侵襲能力。但Pg如何通過刺激ESCC上調IL-6、IL-10的分子機制尚不清楚,以及極化后的TAMs促進ESCC惡性生物學行為的詳細機制仍需一步的研究。

綜上所述,本研究初步探究了Pg感染ESCC細胞通過誘導腫瘤細胞分泌IL-6、IL-10介導TAMs向M2型極化,將TAMs重塑為免疫抑制表型,從而促進食管癌細胞惡性進展,并揭示了Pg對巨噬細胞極化的調節作用,有助于今后更好的解析EC的微環境變化,為臨床上開展以TAMs為靶點的抗腫瘤免疫治療奠定理論基礎。