MBL2作為男性肝癌患者預后標志物的分析與驗證

王延峰,韓嘉奇,張 靜

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發性肝癌的主要組織學亞型,原發性肝癌是2020年全球第六大最常見的癌癥和第三大癌癥死亡原因,男性的發病率和病死率比女性高2～3倍,且預后較差[1]。HCC的發生是一個涉及多種風險因素的復雜過程。慢性肝炎病毒感染、吸煙和過度飲酒是男性患者常見的危險因素[2]。早期篩查、診斷和治療是改善HCC預后的關鍵。然而,性別相關的診斷、預后標志物的缺乏,高轉移和復發率等因素直接降低了手術切除后HCC患者的生存率[3-4]。甘露糖結合凝集素2(mannose binding lectin 2,MBL2)位于人類10號染色體,在先天免疫系統中起著重要作用,而在惡性腫瘤中的關鍵作用是免疫監測,MBL2基因變異是癌癥風險增加的因素之一[5]。目前,在兒童血液腫瘤中發現,MBL2基因的多態性與中性粒細胞減少癥發生相關[6]。而MBL2在HCC中的作用尚不清楚。該研究利用生物信息學技術分析MBL2在不同性別HCC患者中的表達,細胞實驗探究其對HCC細胞增殖的作用,為不同性別HCC患者個性化治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1HCC組織 收集2021年6月—2022年6月在延安大學附屬醫院治療的46例HCC患者組織和癌旁組織(男性23例,女性23例),患者術前未經治療。本研究獲得了患者簽署的知情同意書和延安大學醫學院倫理委員會批準。

1.1.2HCC細胞系 本實驗所使用的人HCC細胞系Huh7和MHCC-97H購買于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html) 在線工具探究MBL2在不同HCC組織樣本中的表達,選擇TCGA dataset中的“Liver hepatocellular carcinoma”模塊進行分析。HCC患者總體生存率在Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis)數據庫中進行。在UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)數據庫中下載HCC樣本的RNA-seq數據,使用基因集富集分析(gene set enrichment Analysis,GSEA)軟件(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)進行單基因富集信號通路分析。

1.2.2細胞培養與細胞轉染 HCC細胞系Huh7和MHCC-97H用含有10%胎牛血清(澳大利亞PAA公司)的DMEM的培養基(澳大利亞PAA公司),置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。用于過表達MBL2基因的質粒購買于上海吉凱生物有限公司,根據jetPRIME試劑使用手冊在HCC細胞中進行過表達質粒的轉染。

1.2.3MTT實驗 將Huh7和MHCC-97H細胞以3×103個/孔的密度接種到96孔板中。質粒分別轉染24、48、72 h后,每孔加入0.01 ml MTT試劑,培養3～4 h。每孔加入0.15 ml二甲基亞砜后,使用酶標儀進行吸光度值的檢測。

1.2.4細胞克隆形成實驗 將Huh7和MHCC-97H細胞按照2×103個/孔的密度接種到6孔板中。質粒轉染24 h后,在12孔細胞培養板中接種,接種密度為1×103個/孔,置于培養箱中培養2周。細胞集落用0.1%結晶紫進行染色,PBS清洗3遍后,在圖像采集系統中拍照。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡 細胞周期:將Huh7和MHCC-97H細胞以1×106個/孔的密度接種到6孔板中,轉染過表達質粒24 h后,用70%乙醇收集細胞,置于4 ℃冰箱過夜。用RNase A和PI使細胞再懸浮,避光收集懸浮液于檢測管中。通過流式細胞術進行細胞周期測定。

細胞凋亡:將Huh7和MHCC-97H細胞以1×106個/孔的密度接種到6孔板中,過表達質粒轉染48 h后,收集細胞,并按照PI/FITC-AnnexinV凋亡檢測試劑盒說明書對細胞進行處理。通過流式細胞術進行細胞凋亡測定。

1.2.6qRT-PCR實驗 使用TRlzol試劑從細胞系和冷凍組織中提取總RNA。逆轉錄試劑盒用于cDNA的合成,根據SYBR green Premix Ex Taq II操作說明書進行qRT-PCR實驗。人MBL2引物(上游5′-GTATGGCAGCGTCTTAC-3′,下游5′-TGTAGCCTCTGGCCCTTG-3′)和GAPDH引物(上游5′-GAGGTGAAGGTCGGAGT-3′;下游5′-CATGGGTGAATCATGGAA-3′)在上海生工生物有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計算MBL2基因的表達量。

1.2.7Western blot實驗 使用RIPA裂解液從細胞系和冷凍組織中提取蛋白質樣品后,BCA試劑盒檢進行蛋白濃度測定,加入20 μl 5×的蛋白緩上樣沖液,煮沸10 min。應用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白質,轉移到PVDF膜上。5%脫脂乳孵育1 h后,使用一抗(1 ∶1 000,武漢三鷹生物技術有限公司)孵育,置于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次后,使用HRP標記的羊抗兔二抗(1 ∶5 000,武漢三鷹生物技術有限公司)在室溫下孵育2 h。再次洗膜3次后,置于化學發光儀中檢測。β-actin作為內參。

2 結果

2.1 MBL2表達與患者性別的關系通過腫瘤數據庫探究MBL2在HCC患者組織中的表達與性別的相關性。在TCGA數據庫中分析表明,HCC組織中的MBL2表達低于正常組織(P<0.05,圖1A),男性患者中MBL2的表達高于女性患者(P<0.05,圖1B),MBL2在HCC中的表達存在明顯的性別差異。

圖1 TCGA數據庫中分析HCC中MBL2的表達

2.2 MBL2表達對患者預后的影響利用生存分析探究MBL2表達對不同性別HCC患者預后的影響。Kaplan-Meier plotter數據庫中分析顯示:與MBL2低表達組比較,MBL2高表達組與男性HCC患者良好的預后顯著相關(Log-rankP=0.017,圖2A),而與女性HCC患者預后無關(Log-rankP=0.42,圖2B),MBL2高表達對HCC患者預后影響存在著顯著的性別差異。

圖2 MBL2表達與HCC患者總生存率的相關性分析

2.3 MBL2在HCC組織中的表達通過在臨床上收集不同性別HCC患者的組織,分析MBL2表達在HCC患者中的性別差異。qRT-PCR結果顯示:與女性HCC患者比較,MBL2在男性HCC患者中的mRNA表達水平顯著增高(P<0.05,圖3A),與數據庫中的結果一致。Western blot 結果表明MBL2在HCC組織中的蛋白表達水平顯著下降(圖3B)。

圖3 HCC組織中MBL2的表達情況

2.4 MBL2在HCC細胞系中的過表達效率檢測在HCC細胞系中轉染MBL2過表達質粒,分為對照組和MBL2過表達組。實驗結果顯示:與對照組比較,Huh7(圖4A)和MHCC-97(圖4B)細胞中MBL2的mRNA和蛋白表達水平在MBL2過表達組中顯著升高(tHuh7=12.050,tMHCC-97H=13.216,均P<0.01),MBL2過表達質粒可用于細胞功能實驗。

圖4 qRT-PCR、Western blot檢測HCC細胞中轉染MBL2過表達質粒后mRNA和蛋白表達水平

2.5 MBL2表達上調對HCC細胞系增殖的影響MTT實驗結果顯示:MBL2表達升高后,轉染過表達質粒48 h以后Huh7和MHCC-97H細胞的活性顯著下降(tHuh7-48 h=4.231,tMHCC-97H-48 h=5.780,tHuh7-72 h=6.124,tMHCC-97H-72 h=6.690,均P<0.05,圖5)。細胞克隆形成實驗表明,MBL2表達下調顯著的抑制了Huh7和MHCC-97H細胞的克隆形成能力(tHuh7=12.311,tMHCC-97H=6.015;PHuh7<0.01,PMHCC-97H<0.05,圖6)。

圖5 MBL2 過表達質粒對HCC細胞系活性的影響

圖6 MBL2 過表達質粒對HCC細胞系克隆形成能力的影響

2.6 MBL2表達上調對HCC細胞系周期和凋亡的影響流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的結果顯示:上調MBL2表達后,顯著的抑制了Huh7(圖7A)和MHCC-97H細胞(圖7B)的分裂(G1:tHuh7=7.030,tMHCC-97H=6.961;S:tHuh7=4.230,tMHCC-97H=3.652;G2:tHuh7=3.001,tMHCC-97H=4.132;均P<0.05),促進了Huh7(圖8A)和MHCC-97H(圖8B)細胞的早凋和晚凋[(早凋:tHuh7=2.990,tMHCC-97H=3.512;均P<0.05);(晚凋:tHuh7=7.625,tMHCC-97H=4.311;PHuh7<0.01,PMHCC-97H<0.05)]。

圖7 MBL2 過表達質粒對HCC細胞系細胞周期的影響

圖8 MBL2 過表達質粒對HCC細胞系凋亡的影響

2.7 MBL2表達調控的信號通路分析GSEA分析顯示,MBL2表達上調顯著的富集在細胞周期信號通路上(P<0.05)。Western blot結果顯示,上調MBL2能夠調控細胞周期信號通路的CDK4、P16、BAX蛋白的表達。見圖9。

圖9 上調MBL2表達對細胞周期信號通路的影響a:對照組;b:MBL2過表達組

3 討論

研究[7]表明,HCC患者HBV感染的流行病學和臨床特征方面存在顯著的性別差異,這與男性HCC發病率和病死率的增高密切相關。然而,對人類HCC中性別依賴性基因表達的認識仍然稀少,研究HCC性別相關的基因可能具有重要的生物學和醫學意義。MBL2位于人類10號染色體,在乙型肝炎病毒感染中發揮重要作用[8],MBL2突變與HCC風險之間的關系尚不清楚。為了改善男性HCC患者的預后,有必要探究MBL2表達對HCC患者預后的影響和作用機制。通過生物信息學分析發現MBL2在不同患者中的表達和預后存在著明顯的性別差異,對男性HCC患者的預后有顯著的影響,而與女性患者預后無相關性,這可能是由于公共數據庫中女性HCC患者的數據量較小導致的,因此,MBL2對女性HCC患者生存的影響需要進一步探究。同時,臨床HCC組織樣本中檢測MBL2的表達結果與公共數據庫分析結果一致,提示其在男性HCC患者的發生和預后中有著重要的作用。本研究對HCC細胞Huh7和MHCC-97H轉染MBL2過表達質粒,進一步分析了MBL2對HCC細胞系增殖的影響。MTT和細胞克隆實驗表明,MBL2基因的表達上調能夠顯著的抑制Huh7和MHCC-97H細胞的增殖,同時細胞周期和凋亡實驗提示MBL2基因表達的上調能夠阻滯Huh7和MHCC-97H細胞的分裂,增加細胞的凋亡率。上述研究表明,MBL2在HCC中發揮著抑癌作用。

細胞周期是一個高度調節的過程,能夠促進細胞生長、遺傳物質的復制和細胞分裂,而細胞周期調節失控是腫瘤細胞過度增殖的重要原因[9]。CDK4、BAX和P16蛋白是細胞周期機制的關鍵組成部分,通過調控G1至S期轉變在癌癥中發揮關鍵作用,如控制增殖、衰老、遷移、凋亡和血管生成[10-11]。研究[12]顯示,微染色體維護家族基因被認為是細胞周期S/G2進展的驅動因素,可做為HCC的潛在診斷和預后標志物。另有研究[13]表明,ASF1B通過影響HCC細胞周期和增殖,可能成為HCC患者治療的新靶點。本研究通過GSEA分析發現,MBL2表達顯著的富集在細胞周期信號通路上,且過表達MBL2能夠影響細胞周期信號通路中的CDK4、BAX和P16蛋白的表達。綜上結果推測MBL2可能是通過調控細胞周期信號通路影響了HCC細胞系的增殖和凋亡,這將為HCC分子機制的研究提供新的方向。

綜上所述,MBL2在HCC患者中的低表達,且與男性HCC患者的預后密切相關。過表達MBL2能夠抑制HCC細胞的增殖,增加細胞凋亡率。MBL2可能是男性HCC患者治療的一個新靶點,MBL2表達在HCC的性別差異機制仍需要進一步探究。