鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表達質粒的構建及其部分功能研究

姚 燕,王淑賢,吳銀翠,胡 爽,胡 穎,潘林鑫,徐 濤

核孔蛋白85(Nucleoporin 85,NUP85)是核孔復合體(Nuclear pore complex,NPC)中NUP107～160亞復合體(同義Y復合體)的9個成員之一[1]。NPC是指鑲嵌在核孔上的一種復雜結構,主要調節大分子跨核膜的運輸。單個核孔蛋白具有基因表達調控、DNA修復、調控細胞凋亡等作用[2]。研究[3]表明,NUP85可與巨噬細胞上表達的C-C-趨化因子受體(C-C-chemokine receptor 2,CCR)2和CCR5相互作用,促進趨化信號傳導。此外,NUP85還可以通過調節腫瘤相關巨噬細胞調節腫瘤進展,并對炎癥具有一定作用[4],但具體調控作用及機制尚不清楚。而炎癥是腫瘤進展的關鍵因素,對調節免疫細胞進出腫瘤微環境具有重要作用。腫瘤細胞產生各種細胞因子和趨化因子,吸引白細胞,包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等[4]。為進一步研究NUP85的功能,該研究通過構建NUP85的真核質粒,首次探討NUP85在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的RAW264.7細胞中對炎癥因子(TNF-α、IL-6)的表達及其對細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料RAW264.7細胞株(安徽醫科大學藥學院保存);DMEM培養基(美國Thermo Scientific公司);NUP85抗體(美國Santacruz公司);IL-6抗體(沈陽萬類生物科技有限公司);TNF-α抗體(南京巴傲得生物科技有限公司);ECL化學發光試劑盒(蘇州新賽美生物科技有限公司);Lipofectamine 2000和Trizol(美國Invitrogen公司);胎牛血清(美國Gibco公司);PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司);Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物有限公司);質粒抽提試劑盒、BamH I、XhoI內切酶(美國Axygen公司);脫脂奶粉(內蒙古伊利實業集團股份有限公司);細胞培養瓶、細胞培養板(無錫耐思生命科技股份有限公司);山羊抗鼠IgG/辣根酶標記、山羊抗兔IgG/辣根酶標記(北京中杉金橋生物技術有限公司);ELISA(IL-6、TNF-α)試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒的構建 通過PCR擴增NUP85基因,構建pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表達質粒。酶切鑒定無誤后,由上海吉瑪制藥技術有限公司進行測序鑒定。

1.2.2pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒的轉染與實驗分組 將細胞按1×106個/孔的密度均勻種入6孔板內繼續培養。將A液(250 μl的Opti-MEM及2 μg pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒)與B液(250 μl的Opti-MEM及5 μl Lipofectamine 2000脂質體)分別置于1.5 ml無酶EP管中靜置5 min后,將A液和B液混勻,靜置20 min后,將其置于6孔板中再補齊Opti-MEM培養基至2 ml。6 h后換液,培養24 h后以進行后續實驗。

實驗分為正常組:未進行任何處理;LPS組:加100 ng/ml LPS刺激;對照組(LPS+pcDNA3.1-3×Flag-c組):轉染空載體質粒并加100 ng/ml LPS刺激;NUP85過表達組(LPS+pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85組):轉染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒并加100 ng/ml LPS刺激。

1.2.3Western blot實驗 棄去6孔板中的培養基,PBS洗3遍,在蛋白裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)中裂解細胞,提出總蛋白。用BCA蛋白質檢測試劑盒檢測蛋白質濃度。取等量的蛋白加入上樣孔,進行SDS-PAG凝膠電泳。在恒流200 mA條件下濕轉60 min,使蛋白轉至PVDF膜上,在脫脂奶粉(50 g/L)中封閉2 h后,用TBST緩沖液清洗,并在相應的一級抗體中孵育12 h,一抗稀釋度分別為NUP85(1 ∶500),TNF-α(1 ∶1 000),IL-6(1 ∶1 000)。TBST洗3遍后,室溫孵育二抗1 h,TBST清洗后用ECL化學發光試劑盒進行顯影并拍照。

1.2.4CCK-8實驗 將RAW264.7細胞按5 000個/孔的密度接種到96孔板中,每組設6個復孔,再向每孔轉染約70 ng pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒,6 h后更換為含100 ng/ml LPS的培養基,再培養24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液,正常培養2 h,在避光條件下檢測每孔在450 nm處的吸光度,計算細胞存活率。

1.2.5流式細胞術 將RAW264.7細胞按1×106個/孔的密度均勻種入6孔板內,轉染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒,6 h后更換為含有100 ng/ml LPS的培養基,繼續培養24 h。然后用PBS清洗3遍,收集所有細胞于15 ml離心管中,用400 μl Annexin V結合液重懸細胞,再加入5 μl FITC避光孵育10～15 min,再加入10 μl PI,避光孵育5 min后,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率,并記錄。

1.2.6ELISA檢測炎癥因子的分泌 將RAW264.7細胞按1×106個/孔的密度均勻種入6孔板內,轉染對照組空載體質粒和pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒,6 h后更換為含有100 ng/ml LPS的培養基,繼續培養24 h。24 h后收集細胞上清液,使用ELISA方法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6的分泌情況,步驟完全按照ELISA(TNF-α、IL-6)檢測試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表達質粒的構建通過PCR方法擴增目的基因,利用Bam H I、Xho I雙酶切擴增產物和pcDNA3.1-3×Flag-c載體,并用T4 DNA連接酶連接兩產物,將連接產物轉化細菌感受態細胞,用抽提試劑盒提取質粒。酶切鑒定結果顯示:pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒成功構建,即陽性克隆顯示在目的條帶大小對應的區域有酶切得到的條帶對應的克隆,如圖1所示。將陽性克隆送至上海吉瑪制藥技術有限公司進行測序鑒定。

圖1 重組質粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85的酶切鑒定

2.2 pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表達質粒的表達用Western blot技術檢測將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒轉染至RAW264.7細胞后的NUP85蛋白表達情況。結果顯示:LPS組的NUP85的蛋白表達量高于正常組(t=7.650,P<0.01);過表達組的NUP85的蛋白表達量高于轉染空載體的對照組(t=10.28,P<0.01),表明pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒成功表達,見圖2。

圖2 重組質粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85的蛋白表達

2.3 NUP85對RAW264.7細胞增殖的影響將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒轉染至RAW264.7細胞中,用CCK-8法檢測細胞的增殖情況。結果顯示:24 h后LPS組和轉染空載體對照組的細胞存活率分別為(0.74±0.08)和(0.67±0.05),過表達NUP85組的細胞存活率為(0.55±0.03),低于LPS組和轉染空載體對照組的細胞存活率(F=30.98,P<0.05),表明在LPS刺激的RAW264.7細胞中,過表達NUP85能夠抑制細胞的增殖,見圖3。

圖3 CCK-8檢測細胞增殖

2.4 NUP85對RAW264.7細胞凋亡的影響用細胞凋亡檢測試劑盒和流式儀檢測將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85過表達質粒轉染至RAW264.7細胞24 h后的細胞凋亡率。結果顯示:24 h后正常組的細胞凋亡率為(6.74±0.46)%,LPS組及轉染空載體對照組的細胞凋亡率分別為(13.13±0.21)%和(13.40±0.47)%,而NUP85過表達組的細胞凋亡率為(15.78±1.05)%,高于對照組(F=75.38,P<0.05),表明在LPS刺激的RAW264.7細胞中,過表達NUP85能夠促進細胞的凋亡,見圖4。

圖4 重組質粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85對RAW264.7細胞凋亡的影響

2.5 NUP85在RAW264.7細胞中對炎癥因子表達的影響用Western blot技術檢測將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒轉染至RAW264.7細胞后的IL-6和TNF-α蛋白表達情況。結果顯示:過表達組中的TNF-α表達較轉染空載體對照組升高(F=174.4,P<0.01);IL-6的表達較轉染空載體對照組升高(F=105.3,P<0.01),表明在RAW264.7細胞中,過表達NUP85促進炎癥因子TNF-α和IL-6的表達,見圖5。

圖5 重組質粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85轉染后Western blot檢測炎癥因子IL-6和TNF-α的表達

2.6 NUP85在RAW264.7細胞中對炎癥因子分泌的影響使用ELISA方法檢測將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒轉染至RAW264.7細胞后的IL-6和TNF-α蛋白分泌情況。結果顯示:過表達NUP85組中的TNF-α表達較轉染空載體對照組升高(F=479.8,P<0.001);IL-6的表達較轉染空載體對照組升高(F=216.5,P<0.001),表明在RAW264.7細胞中,過表達NUP85促進炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌,見圖6。

圖6 重組質粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85轉染后ELISA檢測炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌

3 討論

NUP85作為NUP107～160復合體的一部分,構成了NPC的外環,參與NPC的組裝和維護[5]。NUP85是一種細胞質蛋白,在巨噬細胞中高度表達,參與炎癥,并通過調節腫瘤相關巨噬細胞影響腫瘤進展[3]。而炎癥是腫瘤的基礎過程,緩解炎癥反應對腫瘤的治療十分重要。巨噬細胞通過清除細胞碎片、緩解炎癥,在炎癥和腫瘤中發揮關鍵作用[6]。作為人體內最重要的吞噬細胞之一,RAW264.7細胞負責攝取和消化許多微生物和組織中衰老、死亡和受損的細胞,還可以釋放一系列炎癥介質,例如TNF-α、IL-6等[7]。這些炎癥因子表達水平的變化在炎癥反應中起著重要作用,抑制這些炎癥因子的分泌有助于炎癥的治療。在體外實驗中,常選用LPS誘導RAW264.7細胞作為炎癥細胞模型[6]。因此,本研究在用LPS誘導RAW264.7細胞后,探討NUP85對炎癥因子TNF-α和IL-6表達的影響。此外,細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式,細胞內信號或外源信號均可觸發凋亡,細胞凋亡的改變與腫瘤的發生和發展有關[8]。而NUP85是否對RAW264.7細胞凋亡產生作用,國內外尚未有文獻報道。因此,本實驗也研究了NUP85對RAW264.7細胞凋亡的影響。 雖然NUP85在人類細胞中的確切分子功能仍不清楚,但已知其能與趨化因子受體CCR2和CCR5結合調節趨化信號傳導,在一些動物模型中,CCR2和CCR5的阻斷已被證明可以抑制腫瘤的進展,這使得NUP85成為一個有吸引力的治療靶點[9]。因此,本研究通過構建鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85過表達質粒,初步了解NUP85的功能。酶切鑒定顯示質粒成功構建,并將質粒轉染至RAW264.7細胞,Western blot結果進一步證明質粒成功表達。CCK-8結果顯示NUP85過表達后能夠抑制LPS誘導的RAW264.7細胞的增殖。另流式細胞術檢測NUP85對RAW264.7細胞凋亡的調節作用,結果顯示,NUP85過表達后能夠促進RAW264.7細胞的凋亡。此外,通過向RAW264.7細胞轉染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質粒建立NUP85過表達模型,研究NUP85對炎癥因子IL-6和TNF-α分泌的調節作用。Western blot結果顯示,過表達NUP85后,IL-6和TNF-α的表達水平上調,ELISA結果進一步表明過表達NUP85能夠促進炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌。這些實驗結果表明NUP85能夠抑制RAW264.7細胞的增殖并促進其凋亡,并能促進炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌。這為今后炎癥相關疾病的治療打下了堅實的基礎。另有研究[10]表明,mTOR信號通路在炎癥性疾病中對炎癥具有調節作用,并能抑制部分白細胞介素炎癥因子的產生[11]。基于以上文獻和相關實驗結果,猜測NUP85可能通過mTOR信號通路影響炎癥因子的分泌。然而,NUP85與凋亡和炎癥之間的具體作用機制有待進一步研究。接下來課題組將對NUP85在動物模型和臨床樣本中的潛在應用進行深入研究。