eIF2B1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

齊文月,周大臣,張振華,夏國美,陳 偉,鄒桂舟

原發(fā)性肝癌是全球第六大癌癥,居全世界癌癥相關(guān)病死率的第三位[1]。在我國,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝癌類型,占總病例的85%～90%[2]。肝癌由于其起病隱匿,早期易漏診,大多數(shù)患者確診時已處于疾病的中晚階段,預(yù)后不佳,發(fā)現(xiàn)并研究新的分子靶點,是當(dāng)前HCC的研究熱點內(nèi)容之一。近年來的研究[3]發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,但是在HCC中,目前還缺少足夠的研究數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)的翻譯過程主要包括起始、延長和終止3個步驟,其中翻譯的起始階段被認(rèn)為是蛋白質(zhì)合成中重要的限速步驟,起始因子(translation initiation factor,eIFs)通過調(diào)控遺傳密碼來影響蛋白質(zhì)的翻譯,其中發(fā)揮重要作用的有eIF2、eIF2B、eIF4F復(fù)合物等。eIF2與eIF4F復(fù)合物是蛋白質(zhì)翻譯過程中兩個關(guān)鍵調(diào)控點,前期研究[4]表明eIF4F復(fù)合物對HCC患者有一定的預(yù)后價值,但目前關(guān)于eIF2B1在HCC中表達(dá)的研究較少。基于此背景,該研究致力于探討eIF2B1在HCC中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料胎牛血清購自美國Gibro公司;一抗eIF2B1、eIF2α、P-eIF2α購自美國CST公司;山羊抗兔或抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;HCC細(xì)胞系HepG2和HepG2.2.15購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,其中HepG2細(xì)胞指人肝癌細(xì)胞,HepG2.2.15是指穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HBV DNA的人肝癌細(xì)胞;BCA試劑盒和4%多聚甲醛購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1臨床數(shù)據(jù)的收集與分析 從安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院現(xiàn)有的HCC組織標(biāo)準(zhǔn)庫中,篩選出91例具有完整隨訪信息的,且與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相關(guān)的HCC術(shù)后患者的配對臨床組織(包括腫瘤組織以及距腫物邊緣>2 cm的癌旁組織),制作4套組織芯片(tissue microarray,TMA1～4)。所納入HCC患者的標(biāo)準(zhǔn):① 首次病理確診為HCC;② 患者有乙型肝炎病史,首次診斷為HCC且年齡18～70歲;③ 術(shù)前未行放療、化療及相關(guān)抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn):① 混合型肝癌或合并其他肝臟惡性腫瘤;② 既往或同期伴有其它臟器惡性腫瘤,包括復(fù)發(fā)性HCC;③ 合并自身免疫系統(tǒng)疾病的患者;④ 臨床病理資料不完整患者。隨訪通過與患者或患者家屬的聯(lián)系來保持對出院患者病情的追蹤,具體內(nèi)容包括:① 患者入院以來的肝功能指標(biāo);② 術(shù)后病理報告的腫瘤的大小、數(shù)目以及衛(wèi)星灶;③ 出院之后的3年生存率和5年生存率以及生存狀態(tài)等。該研究已通過安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審查(編號:20200863)

1.2.2免疫組織化學(xué) 將組織芯片在60 ℃烘箱中烤片、脫蠟,然后將烤好的芯片依次放入二甲苯Ⅰ6 min,二甲苯Ⅱ6 min,二甲苯與無水乙醇3 min,無水乙醇6 min,90%乙醇3 min,70%乙醇3 min,50%乙醇3 min,純水10 min梯度脫蠟;再將脫蠟完畢后的芯片放入裝有枸櫞酸鈉緩沖液的染色槽內(nèi),在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù);將芯片浸入30%過氧化氫與甲醇1 ∶9體積混合的混合液中10 min,以封閉過氧化氫酶,用PBS沖洗15 min;破膜液破膜10 min,PBS沖洗15 min;用1%牛血清白蛋白封閉2 h;組織芯片與第一抗體在4 ℃環(huán)境下孵育過夜;室溫下依次加入反應(yīng)增強液20 min、辣根酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物30 min,以DAB為顯色劑,蘇木精5 s復(fù)染,最后用將切片放入50%乙醇3 min,70%乙醇3 min,90%乙醇3 min,無水乙醇6 min,二甲苯與無水乙醇3 min,二甲苯Ⅰ6 min,二甲苯Ⅱ6 min脫水,中性樹脂封片。操作嚴(yán)格按照實驗步驟完成,做好質(zhì)控工作。染色判斷標(biāo)準(zhǔn)為:eIF2B1主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上顯色,以淺黃到棕黃色定為陽性。以無染色、淺黃色、深黃色、黃褐色分別計為 0、1、2、3分。通過用Image J軟件進(jìn)行半定量分析計算陽性細(xì)胞比例,陽性率<5%計為0分,5%～25%計為1分,>25%～50%計為2分,>50%～75%計為3分,>75%計為4分,兩項分值相加為最終評分,總分 0～7分,以≤3分為低表達(dá),以>3分為高表達(dá)。

1.2.3Western blot檢測 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h后,吸去培養(yǎng)液,PBS洗3遍。加入已經(jīng)配制好的蛋白裂解液100 μl冰上孵育25 min;用無菌細(xì)胞刮刮下細(xì)胞裂解液于無菌的1.5 ml離心管,4 ℃、13 200 r/min離心30 min,吸取上清液。采用BCA蛋白濃度檢測法對其進(jìn)行定量,隨后用上樣緩沖液和純水配成等體積等濃度,10 min煮沸使其變性后離心,放置冰上冷卻。使用SDS-PAGE分離總蛋白,并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后,在室溫下用5% BSA TBST溶液中封閉2 h后,在4 ℃下與一抗孵育過夜。第2天,用山羊抗小鼠二抗或山羊抗兔二抗孵育1 h,洗膜后用顯影儀檢測目的蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理使用R 4.0.5及Graphpad Prism 8.0.2軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。患者的臨床特征與目標(biāo)基因的表達(dá)水平通過非參數(shù)檢驗分析,組織芯片中各目標(biāo)基因的表達(dá)水平的相關(guān)性通過程序包PerformanceAnalytics進(jìn)行分析。繪制Kaplan-Meier生存曲線,并通過Cox回歸分析計算各影響因素的HR值,通過Nomogram評估各影響因素與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 eIF2B1在HCC肝臟組織中的表達(dá)及臨床特征相關(guān)性通過對納入的HCC患者的肝臟腫瘤組織中的eIF2B1的表達(dá)進(jìn)行半定量分析,統(tǒng)計eIF2B1在HCC患者中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,肝臟腫瘤組織中eIF2B1的表達(dá)與HCC患者的腫瘤數(shù)目有顯著統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性 (P<0.05),而與性別、年齡、腫瘤最大徑、分期等無顯著統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性 (P>0.05)。見表1。

表1 eIF2B1在不同臨床特征分組中HCC肝臟組織表達(dá)分析

2.2 免疫組化及Western blot法檢測eIF2B1的表達(dá)及與HCC患者的整體術(shù)后生存時間的相關(guān)性通過Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行生存分析可得出結(jié)論,eIF2B1在HBV相關(guān)的肝癌中的表達(dá)與HCC患者總體生存率無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A,P>0.05),但在HBV-DNA陽性患者中,eIF2B1的表達(dá)與HCC患者總體臨床預(yù)后呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(圖1B,P<0.05),eIF2B1高表達(dá)組總體生存率要低于eIF2B1低表達(dá)組;通過IHC染色檢測及Western blot法檢測HBV-DNA陽性的HCC腫瘤組織和癌旁肝組織中 eIF2B1的表達(dá)進(jìn)一步證實了該結(jié)果(圖1C、D)。

圖1 eIF2B1的表達(dá)與HCC患者的整體術(shù)后生存時間的相關(guān)性

本研究納入的患者入院時間主要是2000—2014年,由于當(dāng)時條件及技術(shù)原因,部分指標(biāo)的數(shù)據(jù)納入不全

2.3 eIF2B1與eIF2α、P-eIF2α及臨床特征之間的相關(guān)性分析相關(guān)性分析提示eIF2B1在HBV相關(guān)的HCC細(xì)胞中的表達(dá)與P-eIF2α的表達(dá)及腫瘤的數(shù)目、大小之間呈負(fù)相關(guān)(圖2A、B)。通過Western blot法檢測HepG2.2.15細(xì)胞中eIF2B1以及相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與HepG2細(xì)胞系比較,HepG2.2.15細(xì)胞系中的eIF2B1表達(dá)水平顯著增高,且eIF2B1的調(diào)控基因,如eIF2α以及其磷酸化水平也在兩種不同的細(xì)胞系中體現(xiàn)出表達(dá)差異(圖2C),進(jìn)一步說明并驗證了eIF2B1在HCC中的表達(dá)與HBV感染有關(guān)。

圖2 eIF2B1與eIF2α、P-eIF2α及臨床特征之間的相關(guān)性分析

2.4 eIF2B1在HBV-DNA陽性的HCC肝臟組織中表達(dá)的多因素Cox回歸分析及Nomogram模型以Cox比例風(fēng)險模型為基礎(chǔ),對HBV-DNA陽性患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素Cox回歸分析,并利用Nomogram算法進(jìn)行評分,對各個危險因素的風(fēng)險比例分別給予評分,以各患者最終得分綜合來預(yù)測3年生存率和5年生存率,例如,得分為150分的患者3年生存率、5年生存率分別約為0.92、0.75。可以看到eIF2B1的評分相對較高,提示eIF2B1對于HCC患者預(yù)后生存時間有著顯著的相關(guān)性。見圖3。

圖3 多因素Cox回歸分析及列陣圖模型

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),eIF2B1在HBV-DNA陽性的HCC患者腫瘤組織中的表達(dá)與HCC患者的臨床預(yù)后具有顯著相關(guān)性,提示eIF2B1在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中具有一定的生物學(xué)作用。 國內(nèi)的HCC病例主要是由HBV感染所致,HBV感染通過以下3種機制促進(jìn)腫瘤的發(fā)展:① HBV DNA整合到宿主基因中誘導(dǎo)插入突變;② 由于HBV DNA與宿主基因組的整合和病毒蛋白質(zhì)的活性,導(dǎo)致宿主基因組的不穩(wěn)定性;③ HBV蛋白(HBx、HBc和preS)影響患者細(xì)胞功能、激活致癌通路,與其他危險因素相關(guān)的腫瘤比較,HBV相關(guān)的腫瘤具有更高的染色體改變率[5]。在本研究中,Western blot實驗結(jié)果提示eIF2B1、eIF2α以及其磷酸化水平在HepG2.2.15及 HepG2細(xì)胞系中的表達(dá)具有明顯差異性,這也表明HBV感染會影響基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。

HCC作為一種高增殖性腫瘤[6],在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中涉及到多種基因的突變,蛋白質(zhì)的翻譯在病變過程中起到重要的作用。翻譯的起始階段是其中重要的限速環(huán)節(jié),涉及到多種起始因子(eIFs),其中eIF2是一種α、β和γ亞基組成的GTP酶(GTPase),可被eIF2B激活[7]。eIF2B是一個異源十聚體復(fù)合體,由α到ε 5個亞基組成,分別由5個不同的基因eIF2B1～eIF2B5編碼,位于不同的染色體上[8]。當(dāng)發(fā)生病毒感染或在其他不同脅迫條件下,通過激活GCN2、PERK、PKR和HRI這四種激酶,使eIF2α亞基的Ser51發(fā)生磷酸化,磷酸化的eIF2更強地結(jié)合并抑制eIF2B,阻止非磷酸化的eIF2的循環(huán)[9],從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的抑制。eIF2α的磷酸化激活可影響腫瘤細(xì)胞的生長和抗腫瘤治療的療效,在很多惡性腫瘤中eIF2α的表達(dá)增強,且腫瘤細(xì)胞的增殖與eIF2α的持續(xù)高表達(dá)有明顯的相關(guān)性[7,10]。在本研究中,eIF2α在HCC腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài),且與eIF2B1的表達(dá)呈正相關(guān),這也側(cè)面驗證了該結(jié)論。eIF2B是eIF2特有的鳥嘌呤核苷酸交換因子,通過將釋放的eIF2-GDP循環(huán)到活躍的eIF2-GTP,并招募Met-tRNA形成新的eIF2-GTP·Met-tRNA三元復(fù)合物,這也是翻譯起始階段持續(xù)成功的關(guān)鍵,eIF2B比eIF2α少3～5倍,凸顯了調(diào)節(jié)eIF2B活性的重要性[11]。目前對于eIF2B的研究主要在白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病,也被稱為“中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘減少的兒童共濟失調(diào)”,在eIF2B1～5基因中,任何一個基因突變均可導(dǎo)致白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病。在編碼eIF2B的5個基因中,目前對eIF2B5研究較多,Hou et al[12]通過分析癌癥基因組圖譜中eIF2B5在卵巢癌患者中的表達(dá)來評估預(yù)后意義,結(jié)果顯示eIF2B5低表達(dá)是卵巢癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。此外,研究表明eIF2B5在肺癌和乳腺癌中高表達(dá)[13-14],同時也是大腸癌病情進(jìn)展的生物標(biāo)志物[15]。eIF2Bα表達(dá)水平不足會降低eIF2B的活性,但關(guān)于eIF2B1在HCC中的研究,目前還缺少足夠的研究數(shù)據(jù)。在本研究中,通過對eIF2B1與eIF2α、P-eIF2α之間相關(guān)性的分析,表明eIF2B1與P-eIF2α之間呈負(fù)相關(guān),eIF2B1在HCC肝臟組織中的表達(dá)強于癌旁組織,且通過生存分析也提示在HBV-DNA陽性患者中,低表達(dá)組相較于高表達(dá)組有更好的生存率,提示eIF2B1在HBV相關(guān)的HCC發(fā)生發(fā)展過程中起到了一定的生物學(xué)作用。同時,本研究尚存在一些局限性,樣本量的不足給本研究帶來一定的影響,同時也導(dǎo)致諸多推測無法進(jìn)一步實驗驗證。后續(xù)課題組將收集更多的標(biāo)本數(shù)據(jù),通過進(jìn)一步的體內(nèi)與體外實驗,更全面、更深入地研究eIF2B1在HBV相關(guān)的HCC中的作用。