人參皂苷Rg1促進人牙齦成纖維細胞增殖、遷移及成骨分化的研究

張 昕,李長順,劉 浩,朱紹躍,周 猛,馮 巖,張光東

人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts,HGFs)是牙周組織工程常用的種子細胞[1]。已證實HGFs具有多向分化的潛能,可在不同誘導條件下分化為骨細胞、平滑肌樣細胞以及內皮樣細胞等[2]。人參是一種傳統中藥材,人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1,GsRg1)是其主要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化等功能[3]。研究[4]發現GsRg1可調控間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖、分化、衰老、凋亡,從而影響機體組織修復。Yin et al[5]研究發現,GsRg1可促進牙周膜干細胞(periodontal membrane stem cells,PDLSCs)增殖,增加堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性及骨橋蛋白(osteopontin,OPN)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)等蛋白的表達,從而促進PDLSCs的成骨向分化。然而GsRg1對HGFs增殖、遷移以及成骨機制的研究尚未見報道。因此,該研究探討GsRg1對HGFs增殖、遷移的影響,并驗證GsRg1對HGFs成骨方向分化的影響,初步探索其可能的作用機制,為GsRg1用于牙周組織修復再生及牙周病的治療提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑GsRg1單體(純度98%,微科曼得生物工程有限公司);DMEM高糖培養基、DAPI染色試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);I型膠原蛋白酶、Dispase Ⅱ(美國Gibco公司);CCK-8試劑盒、Triton X- 100、正常山羊血清、青-鏈霉素雙抗(微科曼得生物工程有限公司);Vimentin抗體、Cytokeratin17抗體、488熒光標記紅色山羊抗兔子IgG(美國Proteintech公司);Transwell過濾器培養板(美國BD公司),倒置光學顯微鏡(日本Nikon公司);磷酸鹽緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司);0.25%胰酶細胞消化液(微科曼得生物工程有限公司);兔抗β-actin抗體、兔抗PI3K抗體、兔抗p-PI3K抗體、兔抗AKT抗體、兔抗p-AKT抗體(上海碧云天生物技術有限公司);兔抗OCN抗體,兔抗I型膠原蛋白(collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)抗體,兔抗OPN抗體(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1HGFs的提取與培養 徐州醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科門診選取18～22周歲健康成年患者因正畸需要拔除前磨牙或第三磨牙,已獲得供者本人知情同意,牙齒無齲壞、牙髓炎、牙周炎等疾病,牙齒周圍牙齦質地及色澤正常,無炎癥腫脹。行拔除術前以75%乙醇充分消毒牙體周圍組織,切取拔牙創周圍的牙齦組織,立即置于含雙抗的預冷DMEM中,迅速轉移到實驗室。

在超凈工作臺內,用含雙抗的PBS沖洗3次后,將組織塊剪成1～3 mm3的大小,采用胰酶消化法,37 ℃下水浴鍋中消化組織2 h,然后加入含20%血清的DMEM培養液終止消化,離心去除上清液后再次加入含20%血清的DMEM培養液,吹打均勻后將細胞懸液放入培養皿中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,每3 d換液1次。當細胞融合至80%～90%后,棄培養液,PBS清洗,用0.25%胰蛋白酶消化5 min得到細胞懸液,離心去上清夜,重新加入含20%血清的DMEM培養液重懸細胞,傳代獲得實驗用細胞,取第3代HGFs進行實驗。該項目由徐州醫科大學附屬口腔醫院倫理委員會批準、審查(批準號:202009w014)。

1.2.2HGFs的免疫熒光鑒定 將第3代HGFs以3×104個/ml密度均勻接種于24孔板中的爬片上,待細胞鋪滿爬片約 60%時棄去培養液;用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,干燥后PBS液洗滌;然后0.5%Triton X-100室溫通透20 min;爬片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30 min以減少非特異性背景著色;加一抗[鼠抗人波形絲蛋白(Vimentin)抗體、鼠抗人細胞角蛋白(CK)抗體]4 ℃孵育過夜;次日復溫30 min后加山羊抗兔二抗于37 ℃濕盒內避光孵育1 h;用DAPI處理30 min后PBS液沖洗3遍,封片。用熒光顯微鏡采集細胞圖像。

1.2.3不同濃度GsRg1溶液配置 取20 mg GsRg1粉末,用含10% FBS的DMEM培養液配置濃度為100 mg/L的GsRg1溶液,然后按比例稀釋,配成含0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L的GsRg1、10%FBS的DMEM 培養液,長期低溫密封保存。

1.2.4CCK-8法檢測GsRg1對HGFs增殖的影響 取生長良好的第3代HGFs,配制濃度為4×104個/ml的單細胞懸液,以每孔100 μl接種于96 孔培養板中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中預培養24 h,換液,每孔加入100 μl不同濃度(0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)的GsRg1,0 mg/L為陰性對照,每個濃度設5個復孔,置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養。分別于2、24 h后,按照CCK-8法說明書進行操作,每孔加入10 μl的CCK-8,將培養板在培養箱中孵育2 h,用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.5Transwell實驗檢測GsRg1對HGFs遷移的影響 取生長良好的第3代HGFs細胞,配制濃度為1×105個/ml的單細胞懸液,經血清饑餓12 h后,以每孔100 μl接種于Transwell上室,下室置入500 μl 1%胎牛血清α-MEM培養基,分別用0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L GsRg1處理細胞,然后分別于6、8、12、24 h后將下室經甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色并在倒置顯微鏡下觀察計數小室下表面的活細胞數。

1.2.6ALP活性檢測 取生長良好的第3代HGFs細胞,經胰蛋白酶消化計數,將HGFs密度調整為2×104個/ml,接種在24孔板內,待細胞貼壁80%后,實驗分組:實驗組加入100 mg/L GsRg1處理,對照組0 mg/L GsRg1處理。培養4、7 d后,吸出原有培養基,PBS洗滌3次,接著用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌,隨后每孔加入配制好的ALP顯色劑避光染色30 min,PBS洗滌后用光學顯微鏡觀察并拍攝圖像。

為了檢測ALP活性的定量表達,細胞培養4、7 d后,PBS沖洗,每孔加入100 μl 1%曲拉通 X-100,置于冰上裂解30 min,反復吹打后收集裂解液。裂解液置于冷凍離心機4 ℃溫度下,以12 000 r/min的轉速離心10 min,吸取上清液。根據BCA蛋白定量試劑盒的說明,測定上清液的總蛋白濃度,并根據ALP活性檢測試劑盒的說明,計算樣品的ALP活性。

1.2.7茜素紅染色 取生長狀態良好的第3代HGFs,胰蛋白酶消化計數后,將HGFs密度調整為2×104個/ml接種在6孔板中,待細胞貼壁生長至80%時,去除培養液,實驗分組:對照組僅添加成骨誘導培養液(含10% FBS的α-MEM、0.05 μg/LL-抗壞血酸磷酸、10 mmol/L β-甘油磷酸、10 nmol/L地塞米松),實驗組分別添加濃度12.5、100 mg/L GsRg1的礦化誘導培養液,分別培養14 d,吸去原培養液,PBS漂洗3遍。每孔加入1 ml的4%多聚甲醛固定40 min。吸去固定液,PBS洗滌。每孔加入1 ml茜素紅染色液,染色5 min。吸去染色液,PBS反復漂洗至液體顏色不變紅。室溫烘干,倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄各組培養皿表面鈣結節的染色情況。采集圖像后,6孔板每孔加入CPC處理10 min,收集液體樣本,測定OD值。

1.2.8成骨相關基因表達的檢測 將HGFs以2×104個/ml的密度接種在24孔板內。實驗分組:實驗組每孔加入2 ml含100 mg/L GsRg1的α-MEM進行培養,對照組每孔加入2 ml(0 mg/L GsRg1)α-MEM進行培養。在培養4、7 d后,吸出原有培養基,PBS洗滌3次,每孔內加入200 μl的Trizol裂解細胞,反復吹打后將裂解液收集至1.5 ml的EP管中。隨后每管加入三氯甲烷抽提RNA,于冷凍離心機4 ℃溫度下,以12 000 r/min的轉速離心15 min,吸取上清液至EP管中。接著每管加入等量的異丙醇沉淀RNA,于冷凍離心機4 ℃溫度下,以12 000 r/min的轉速離心5 min,留沉淀。然后每管加入DEPC水配制的75%無水乙醇洗滌沉淀,于冷凍離心機4 ℃溫度下,以12 000 r/min的轉速離心5 min,沉淀洗滌3次。接著倒置EP管晾干沉淀,每管加入DEPC水來溶解沉淀,使用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。最后用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,用實時定量PCR試劑盒檢測COL-Ⅰ、OCN和OPN基因的相對表達。實驗中以GAPDH基因作為內參,各基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.9Western blot實驗檢測OPN、OCN、COL-Ⅰ蛋白表達 取生長良好的HGFs均勻鋪于6孔板中,細胞培養箱培養至細胞貼壁生長至80%,實驗分組:實驗組100 mg/L GsRg1處理,對照組不做處理。分別在第7、14、21天收集蛋白樣品。采用RIPA細胞裂解液冰上裂解15 min,在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min,提取上清溶液,即為實驗用蛋白樣品。采用BCA法進行蛋白質定量,制備蛋白電泳樣品。對兩組蛋白樣品電泳并轉移至轉膜上封閉2 h。孵育一抗:加入兔抗OCN抗體、兔抗COL-Ⅰ抗體、兔抗OPN抗體,在4 ℃環境下孵育過夜,PBS沖洗3次,清理殘余一抗。孵育二抗:加入HRP標記的二抗(山羊抗兔IgG),室溫孵育2 h,PBS沖洗3次。進行ECL化學發光法檢測,顯色后進行半定量分析。

1.2.10Western blot實驗檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達 取生長良好的HGFs均勻鋪于6孔板中,細胞培養箱培養至細胞貼壁生長至80%,實驗分組:實驗組100 mg/L GsRg1處理細胞4、8、12、24 h,對照組不做處理,相同培養條件下靜置24 h。收集蛋白樣品,按1.2.9 實驗方法檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達情況。

2 結果

2.1 HGFs的分離與培養采集不同代次細胞,觀察其在倒置顯微鏡下的圖像(圖1A、B)。觀察到細胞生長良好,形態穩定,絕大多數呈梭形,胞質豐滿,胞核位于細胞中央,呈圓形或橢圓形。細胞長滿時,呈漩渦狀分布,是HGFs的典型形態。

圖1 分離和培養HGFs ×40

2.2 HGFs免疫熒光鑒定熒光顯微鏡下觀察:細胞為長梭形或紡錘形,細胞核為圓形或橢圓形,Vimentin染色陽性(細胞核為藍色,細胞胞漿為綠色,圖2A1～3),CK染色陰性(細胞核為藍色,細胞胞漿不顯色,圖2B1～3)。

圖2 HGFs的免疫熒光鑒定 × 200

2.3 不同濃度GsRg1對HGFs增殖的影響HGFs中加入不同濃度的GsRg1培養 24 h,所測的吸光度值隨GsRg1濃度的增高逐漸升高。6.25 mg/L GsRg1組吸光度值與對照組比較差異無統計學意義,其余4組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05,圖3)。

圖3 GsRg1對HGFs增殖的影響

2.4 GsRg1對HGFs遷移的作用Transwell實驗結果顯示,與對照組比較,HGFs中加入不同濃度的GsRg1培養后,穿膜細胞數量增多,而且細胞遷移能力隨著GsRg1給藥濃度升高而增強(圖4)。

圖4 GsRg1對HGFs遷移能力的影響 ×40

2.5 GsRg1對HGF的ALP表達作用ALP染色及ALP活性定量實驗檢測GsRg1 (100 mg/L)對HGFs的ALP表達的影響。ALP染色結果顯示,實驗組染色比對照組深。第4、7天,實驗組 ALP活性均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.01,圖5)。

圖5 GsRg1對HGFs ALP活性的影響 ×40

2.6 茜素紅染色結果在光學顯微鏡下觀察各組HGFs培養染色情況,結果顯示實驗組紅染結節明顯多于對照組。鈣結節定量結果與茜素紅染色一致,實驗組吸光度值較對照組升高(P<0.01),且100 mg/L GsRg1的吸光度明顯高于12.5 mg/L GsRg1 (P<0.01)。見圖6。

圖6 GsRg1對HGFs成骨能力的影響 ×40

2.7 qRT-PCR結果qRT-PCR 實驗檢測成骨相關基因(OPN、OCN、COL-Ⅰ)在第 7、14 天的相對表達水平。結果表明:不同組間OPN的表達差異有統計學意義(F=11.25,P<0.05),不同組間OCN的表達差異有統計學意義(F=40.77,P<0.05),不同組間COL-Ⅰ的表達差異有統計學意義(F=26.565,P<0.05)。與對照組比較,實驗組明顯上調了HGFs中成骨相關因子OPN、OCN、COL-Ⅰ的mRNA表達量,差異均有統計學意義(P<0.05,圖7)。

圖7 qRT-PCR檢測成骨相關基因的表達

2.8 GsRg1對HGFs成骨相關蛋白表達Western blot法檢測兩組HGFs成骨相關蛋白表達。結果表明:與對照組比較,實驗組HGFs成骨蛋白OPN、OCN、COL-Ⅰ的蛋白表達水平明顯上調,差異有統計學意義(P<0.05, 圖8)。

圖8 GsRg1對HGFs成骨相關分子在蛋白水平的影響

2.9 GsRg1處理激活HGFs的PI3K/AKT的通路Western blot法檢測兩組HGFs的PI3K/AKT通路的蛋白表達情況。結果表明:實驗組HGFs的p-PI3K、p-AKT兩種蛋白表達水平隨時間推移上調變化明顯,差異有統計學意義(P<0.05,圖9),而實驗組HGFs的PI3K、AKT蛋白表達水平隨時間推移無明顯差異。

圖9 GsRg1對HGFs PI3K/AKT通路蛋白表達的影響

3 討論

牙周病可導致牙周附著喪失、牙槽骨破壞和吸收。牙周病治療的主要目的在于促進牙周組織再生[6]。HGFs易于取材、定向增殖分化能力優異,在一定條件下具有成骨向分化能力,在牙周組織再生的研究中成為理想的種子細胞[7]。

本實驗以HGFs為切入點,采用組織塊法進行HGFs的體外分離培養,免疫熒光鑒定細胞抗Vimentin染色陽性、抗CK染色陰性說明細胞來源于結締組織。不同濃度的GsRg1作用于HGFs后,CCK-8法和Transwell細胞遷移實驗結果顯示,GsRg1能夠促進HGFs細胞的增殖、遷移能力。組織的修復和再生都離不開細胞增殖和遷移,這一實驗結果預示著GsRg1在組織工程研究中的應用潛力。

ALP是成骨早期標志物,當細胞分化成骨時,ALP的活性明顯提高,這一特性被廣泛應用于驗證細胞成骨能力的實驗中[8-9]。有學者在GsRg1對小鼠骨髓干細胞(bone marrow stem cells,BMSCs)的研究中發現,與0 mg/L GsRg1比較,100 mg/L GsRg1作用于BMSCs后,ALP活性明顯提高,說明有大量的成骨細胞形成;另有研究[10]發現,經過1 μmol/L濃度的GsRg1培養后,PDLSCs的 ALP 活性顯著提高,說明GsRg1具有促進PDLSCs 成骨分化的能力。本實驗中100 mg/L GsRg1作用于HGFs后,ALP活性明顯增高,表明GsRg1對HGFs早期成骨分化具有促進作用。

鈣結節是成骨晚期形成的一種標志物,茜素紅染色結果顯示實驗組紅染結節明顯多于對照組,鈣結節定量檢測顯示實驗組吸光度值明顯高于對照組,且100 mg/L GsRg1的吸光度值明顯高于12.5 mg/L GsRg1,表明GsRg1具有促進HGFs晚期成骨分化的作用,且隨著濃度的升高,促進作用增強。

OCN是成骨分化中期重要的標志物[11],可以用于檢驗成骨細胞活性。OPN是一種重要的骨基質蛋白,與骨的形成和礦化密切相關[12]。COL-Ⅰ是由成骨細胞分泌的骨基質中最主要的纖維膠原成分,可有效刺激細胞的黏附和成骨分化[13]。qRT-PCR和Western blot實驗顯示:與對照組比較,實驗組的OCN、OPN、COL-Ⅰ mRNA和蛋白表達水平增高,說明100 mg/L GsRg1具有促進HGFs成骨分化的效果。

PI3K/Akt 信號通路與細胞生長、增殖、蛋白合成、新陳代謝和凋亡等生物活動密切相關[14]。研究[15]表明PI3K/AKT信號通路與骨生成和軟骨內骨化密切相關,激活 PI3K/Akt 信號通路可促進 BMSCs、PDLSCs 的增殖和成骨分化,促進成骨相關因子 ALP、Runx2、OCN 等的表達。Western blot實驗檢測GsRg1作用于HGFs后的PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達,結果發現實驗組p-PI3K/p-AKT蛋白表達水平隨給藥時間的延長而明顯上升,而PI3K/AKT蛋白表達隨時間推移無明顯改變,可能的原因是成骨基因的蛋白水平表達升高,進而激活PI3K/AKT信號通路,從而推斷GsRg1有可能通過激活PI3K/AKT信號通路達到促進HGFs成骨分化的作用。這一推論仍有待后續實驗進一步完善論證。

綜上所述,GsRg1可以提升HGFs增殖、 遷移以及成骨分化能力,其作用機制可能與PI3K/AKT信號通路的激活有關。本研究將為GsRg1在牙周組織再生工程中的應用提供參考,證實其在口腔醫學領域有廣闊的應用前景。但GsRg1促進HGFs成骨分化的作用機制是否與PI3K/AKT信號通路的激活有關仍需實驗進一步證實。