JAK抑制劑托法替布治療類風濕關節炎相關間質性肺病的實驗研究

蔣 總,姚曉玲,唐 芳,馬武開,蘭維婭, 姚血明,安 陽, 劉正奇

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種多器官、多系統受累的免疫性疾病[1]。普通型間質性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)是RA-間質性肺病(interstitial lung disease,ILD)中最常見的類型之一,也是RA死亡的主要原因之一[2]。目前RA-ILD的發病機制尚不清楚,且缺乏有效的治療手段。因此,探索RA-ILD的發病機制及尋求有效治療藥物尤為重要。目前研究證實JAK信號通路與RA密切相關,相關藥物已經批準用于臨床[3]。臨床中也發現托法替布(JAK抑制劑)不僅能有效緩解RA病情,還能緩解ILD影像學表現。已有研究[4]報道發現ILD與JAK信號通路有明顯的相關性,但無明確的證據顯示JAK信號通路與RA-ILD發病的關系。該研究通過建立RA-ILD動物模型,研究托法替布抑制JAK信號通路治療RA-ILD的分子機制,為臨床治療RA-ILD提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料博來霉素[批號:60216ES60,翌圣生物科技(上海)股份有限公司];醋酸潑尼松片(批號:20200902,華中藥業股份有限公司);托法替布(批號:1H08112DC2,齊魯制藥有限公司);伊紅染色液、蘇木精染色液、PBS購自賽維爾生物科技有限公司;ELISA試劑盒:腫瘤壞死因子( tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10和IL-1β購自瑞新生物科技有限公司;JAK1、STAT1、GAPDH抗體、二抗購自愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 動物24只雄性Wistar大鼠,40～50日齡,購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司,在通風良好的房間內飼養,并在晝夜12 h/12 h的光照和黑暗循環中保持。所有實驗方案按照《實驗動物護理和使用指南》執行,動物實驗經貴州中醫藥大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.3 方法

1.3.1動物分組與建模 大鼠隨機分為正常組、ILD模型組、醋酸潑尼松組、托法替布組,每組6只。除正常組外,其余3組大鼠麻醉仰臥位固定于手術臺上,經氣管插入18號大鼠導管后注入博萊霉素溶液3 mg/(ml·kg)造模。造模4周后,正常組、ILD模型組予1 ml/100 g生理鹽水灌胃,醋酸潑尼松組(醋酸潑尼松用生理鹽水溶解)以6 mg/kg的劑量、1 ml/100 g的體質量灌胃;托法替布組以1 mg/kg的劑量、1 ml/100 g的體質量灌胃,4組灌胃均為每日1次,連續灌胃28 d后處死動物取材做后續實驗。

1.3.2HE染色 將肺組織用PBS清洗后用多聚甲醛固定,分別置于不同濃度乙醇中脫水后予二甲苯浸泡,放置于融化的石蠟中,用切片機將石蠟塊中的組織切成2.5 μm厚的薄片,將切片放置于55 ℃烤片機上,使組織片緊貼于防脫玻片上,再次脫蠟、復水,蘇木精染液染色,鹽酸乙醇溶液進行分脫色,伊紅染液染色,乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片,顯微鏡對切片進行圖像采集。

1.3.3ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達 按照試劑盒說明書:設置標準品孔和樣本孔,加入不同濃度的標準品50 μl(樣本孔先加待測樣本10 μl和釋品40 μl),每孔加入檢測抗體100 μl,用封板膜封住孔板,37 ℃放置60 min棄去板孔中液體加滿洗滌液,靜置后棄去洗滌液,重復5次,每孔加入底物A、B各50 μl,37 ℃避光孵育15 min后,每孔加入終止液50 μl,在450 nm波長處測定各孔的吸光度(optical density,OD)值。

1.3.4Western blot法檢測肺組織中JAK1、STAT1蛋白表達 將組織放在研缽中,加入適量液氮冷凍組織后研磨組織成粉末,加入RIPA裂解液充分裂解細胞并提取上清,制膠,放入電泳槽。分別從各樣本總蛋白中取出500 μg與5×SDS上樣緩沖液按4 ∶1比例混合,混合后蛋白的濃度為3.3 μg/μl,金屬浴加熱100 ℃ 6 min使蛋白變性后上樣進行電泳,電泳完畢后取出膜并做好正反面標記,在TBST中清洗1 min,然后用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉1 h后用TBST洗3次,用一抗稀釋液按1 ∶1 000稀釋一抗,4 ℃孵育過夜,用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1 ∶2 000),然后室溫孵育1 h,TBST清洗3次,將曝光液均勻覆蓋在整片膜上反應后放入曝光儀曝光檢測。

1.4 統計學處理采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析,圖片使用GraphPad 9.4.1軟件制作。計量資料符合正態分布及方差齊性采用單因素方差分析,非正態或方差不齊采用秩和檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況正常組自實驗開始至結束精神狀態可,皮毛光澤,反應靈活,飲食、飲水量、呼吸頻率均正常,體質量自然增長;ILD模型組造模1 d后出現活動減少,毛色欠光澤、蜷縮,呼吸加快,聳毛、飲食和飲水減少,體質量減輕,實驗后期體質量緩慢增長,飲食、飲水較少;醋酸潑尼松組造模后逐漸出現活動減少,毛色欠光澤,輕度聳毛、蜷縮、飲食減少,灌胃干預后體質量逐漸緩慢增長,呼吸頻率逐漸緩慢至正常;托法替布組造模1 d后逐漸出現活動減少,毛色欠光澤,聳毛、蜷縮、飲食減少,灌胃干預后飲食逐漸恢復,體質量增長速度緩慢。

2.2 HE染色正常組肺泡結構清晰,肺泡壁結構完整正常。ILD模型組肺組織對比正常組趨向實化,大多數肺泡壁毛細血管充血,肺泡壁增寬增厚;血管及支氣管周圍淋巴細胞浸潤,肺泡腔內有炎性滲出物;支氣管管腔內有大量脫落的上皮細胞及炎癥細胞;可見少量心衰細胞。與ILD模型組比較,醋酸潑尼松組肺泡壁增厚現象減輕,肺組織實化有所改善,但仍可見大量肺泡壁毛細血管充血、支氣管管腔上皮細胞脫落及少量炎癥細胞浸潤。與ILD模型組比較,托法替布組肺泡壁增厚現象減輕,肺泡組織結構較為清晰,趨向正常組;少量肺泡壁毛細血管充血,支氣管管腔內可見少量脫落的上皮細胞及炎癥細胞,偶見炎性滲出物分布于肺泡腔內。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理切片A:正常組;B:ILD模型組;C:醋酸潑尼松組;D:托法替布組

2.3 Western blot法檢測肺組織中JAK1和STAT1的蛋白表達ILD模型組中JAK1和STAT1的總蛋白水平高于正常組(P<0.01),經藥物干預治療后JAK1和STAT1的總蛋白水平低于ILD模型組(P<0.01);兩組藥物治療比較:JAK1在醋酸潑尼松組與托法替布組比較差異無統計學意義(P>0.05),STAT1在醋酸潑尼松組與托法替布組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組肺組織中JAK1和STAT1的蛋白表達

2.4 ELISA測定大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β含量與正常組、醋酸潑尼松組、托法替布組比較,ILD模型組中TNF-α、IL-6、IL-1β濃度增高(P<0.01),IL-10濃度降低(P<0.01);與醋酸潑尼松組比較,托法替布組TNF-α、IL-6、IL-1β濃度增高(P<0.05),IL-10濃度降低(P<0.01)。以上結果表明托法替布可有效降低ILD血清水平TNF-α、IL-6、IL-1β及上調抑炎因子IL-10的表達發揮抗炎作用。見圖3。

圖3 血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β表達

3 討論

RA發病過程中的關鍵細胞因子包括干擾素(interferons,INF)-α/β、IL-1、IL-6、IL-10和TNF等[5]。正常情況下,這些被分泌至胞外的細胞因子或促進炎癥或抑制炎癥,相互調節,最終維持機體的免疫穩態。然而,在RA患者體內的促炎/抑炎因子穩態被打破,最終導致疾病的發展[6]。

JAK-STAT信號通路具有廣泛的功能,是細胞外促炎因子通過膜受體向核內傳導炎性信號的重要信號通路[7]。JAK是酪氨酸激酶的一種非跨膜形式,包括JAK1、JAK2、JAK3,STAT為信號轉導和轉錄激活因子,在信號轉導和基因轉錄中起著關鍵作用,JAK3主要通過與IL2Rγ鏈的細胞因子(IL-2、IL-4、IL-7、IL-9)結合從而活化T細胞,JAK1則主要與γ鏈的細胞因子結合,如IL-6、IL-10、IL-13及INFγ[8]。而T細胞及其分泌的TNF-α、IL-17等炎性因子在RA的發生發展過程中發揮重要的作用[9]。

在ILD患者體內存在大量的炎癥因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10,而IL-1β、IL-6可以同時激活JAK1和JAK2通路,與受體耦聯的JAK相互靠近并激活[10]。STAT1是成纖維細胞生長停滯的重要調節器,異常表達的JAK/STAT1信號通路在早期肺泡炎癥及肺纖維化的形成過程中發揮重要作用[11],STAT1誘導炎癥細胞在肺內聚集,引起血小板源性生長因子大量分泌,刺激平滑肌細胞、成纖維細胞增殖,從而導致肺纖維化形成。而TNF-α/β、IL-6、IL-10作為STAT1的重要始動因子,能激活STAT1并發生磷酸化,而TNF-α已被證明能增強炎癥反應,促進纖維化,并推動肺炎性疾病的進展,IL-6作為促炎因子和促纖維化因子在肺纖維化中發揮作用,并在早期中和IL-6可改善肺纖維化[12]。相反,IL-10作為一種抗炎細胞因子,已經被證明對RA和ILD有保護作用[13]。Nakagome et al[14]報道小鼠靜脈注射IL-10表達質?？梢种撇┤R霉素誘導ILD小鼠TGF-β的產生,改善纖維化,從而誘導肺成纖維細胞的增殖,JAK/STAT信號通路的激活上調了TNF-α、IL-6等促炎性細胞因子的表達,導致炎癥反應,說明JAK/STAT信號通路與肺纖維化密切相關[15]。

托法替布是作用于JAK-STAT信號通路的小分子JAK抑制劑(主要抑制JAK1和JAK3,輕度抑制JAK2),是近年來治療RA的新型藥物。本研究發現托法替布可通過抑制JAK/STAT使下游炎性細胞因子的合成減少起到治療RA-ILD的作用。在本研究中,托法替布可有效改善ILD肺部組織病理及血清中炎癥因子表達,有望在今后的RA-ILD臨床治療提供新的方案。但本研究藥物干預僅為28 d,希望在今后的研究中能有更長的周期進一步觀察托法替布對RA-ILD的有效性及安全性。此外,鑒于構建RA-ILD動物模型均為先構建RA動物模型后再予博來霉素構建ILD模型,并不能代表RA-ILD模型,因此,對RA-ILD動物模型的構建同樣也是一個值得探索的方向。

綜上所述,本研究表明,托法替布通過調控JAK/STAT信號通路,抑制下游炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及上調抑炎因子IL-10的表達,顯著減輕ILD肺部炎癥。托法替布通過調控JAK/STAT信號通路治療ILD是一種很有前途的新方法,值得臨床進一步推廣應用。