妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥大鼠肝損傷及其腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究

何劉媛,張 彬,張和平,沈繼龍,徐元宏,沈續(xù)航

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)常見于孕中晚期。我國孕婦的患病率低于國外報(bào)道,但仍達(dá)0.95%～6.00%[1]。本病主要表現(xiàn)為皮膚瘙癢、肝功能異常、進(jìn)行性黃疸和血清總膽汁酸(total bile acid,TBA)水平升高等,嚴(yán)重者可導(dǎo)致早產(chǎn)、死胎及新生兒抑郁和呼吸窘迫綜合征等[2-3]。母體孕期腸道和生殖道菌群均有明顯改變,以適應(yīng)胎兒宮內(nèi)發(fā)育和分娩,并為出生嬰兒體內(nèi)菌群的定植做準(zhǔn)備[4]。母體腸道共生菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)參與了孕婦脂質(zhì)代謝和糖代謝,對于維持妊娠發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[5]。已知腸道菌群的豐度和多樣性與宿主的年齡、孕期、居住地、飲食習(xí)慣和健康狀態(tài)密切相關(guān)。既往的臨床病例研究尚未揭示ICP與腸道菌群變化的因果關(guān)系,ICP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對腸道菌群及其對代謝的影響鮮見報(bào)道。該研究建立了ICP大鼠模型,探討ICP對肝臟損傷、膽汁酸代謝以及腸道菌群的影響,旨在為ICP發(fā)病機(jī)制研究和臨床診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級SD大鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,雌性大鼠40只,6周齡,體質(zhì)量220～270 g,有生育能力的雄性大鼠13只。在室溫18～28 ℃、相對濕度40%～70%的環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng),自由飲水和飲食,適應(yīng)環(huán)境1周。發(fā)情期按雌雄比例3 ∶1合籠飼養(yǎng),每日觀察陰栓脫落情況,將陰栓脫落日定為妊娠第1天,飼養(yǎng)至妊娠第10天待用。所有動(dòng)物試驗(yàn)操作符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例(2021)》要求。

1.2 主要試劑與儀器苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液(上海全宇生物科技有限公司);全自動(dòng)生化儀au5800 (美國貝克曼公司);奧林巴斯BX50系列生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司);組織病理切片機(jī)RM2016(德國徠卡公司);其余器材由病原生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 ICP 大鼠模型制備將妊娠第10天的SD大鼠40只隨機(jī)分為對照組15只和ICP組25只。妊娠第10～14天分別給予對照組大鼠腹腔注射生理鹽水2.5 ml/kg,ICP組大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇2.5 mg/kg聯(lián)合黃體酮75 mg/kg。以上藥物每天注射1次,連續(xù)注射5 d。

1.4 標(biāo)本采集與檢測妊娠第15天采用無菌濾紙收集各組大鼠糞便,-80 ℃臨時(shí)保存,用于腸道菌群16S rDNA測序。各組大鼠腹腔注射6%水合氯醛溶液 250 mg/kg麻醉,分別取靜脈抗凝血2 ml,1 500 r/min離心10 min,取上層血清,應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測定血清中總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT) 、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST) 、谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamyl transferase,GGT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和TBA水平。血清TBA及肝酶水平異常升高即視為ICP大鼠模型制備成功。大鼠腹腔注射水合氯醛250 mg/kg,麻醉后留取左葉肝臟1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小,置于10%甲醛溶液中固定48 h;經(jīng)脫水、透明、浸蠟制作石蠟組織切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,顯微鏡下觀察肝臟病理變化。

1.5 糞便16S rDNA測序?qū)⑸鲜鍪占拇笫笮迈r糞便置于無菌收集管中,標(biāo)記,送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司測序分析。采用DNA抽提試劑盒對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量的樣品于離心管中,如果有必要?jiǎng)t使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μl。以稀釋后的基因組 DNA為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode的特異引物,Takara公司的 Takara Ex Taq 高保真酶進(jìn)行PCR,確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。測序區(qū)域16S的引物區(qū)域V3～V4前端通用引物為 343F 5′-TACGGRAGGCAGCAG -3′;后端引物為 798R 5′-AGGGTATCTAATCCT-3′。PCR 產(chǎn)物電泳檢測,磁珠純化后作為模板,進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增,并再次電泳檢測和磁珠純化,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量。根據(jù) PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,并上機(jī)測序。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血清生化指標(biāo)比較與對照組比較,ICP組大鼠血清反映肝細(xì)胞損傷和膽汁酸代謝的TBIL、ALT、AST、GGT、ALP和TBA等指標(biāo),于造模給藥后第6天顯著升高(P<0.05)。兩組大鼠血清生化指標(biāo)水平比較見表1。

表1 兩組大鼠肝臟生化指標(biāo)檢測比較

2.2 肝臟肉眼觀察和組織病理檢查對照組大鼠肝臟外觀呈紅褐色,質(zhì)軟光滑,邊緣銳利;ICP組大鼠肝臟輕度腫脹,呈暗紅色,邊緣圓鈍,可見棕黃色脂肪顆粒沉積。鏡下組織觀察見到,對照組大鼠肝細(xì)胞排列方式呈現(xiàn)以中央靜脈為中軸,向邊沿部放射狀分布,所形成的肝板和肝血竇的排列及結(jié)構(gòu)未見明顯異常 (圖1A);而ICP組匯管區(qū)可見肝細(xì)胞水腫和脂肪變性,伴有顯著的炎性細(xì)胞浸潤,部分可見膽栓形成 (圖1B)。

圖1 大鼠肝臟HE染色 ×400 A:正常組;B:ICP組

2.3 腸道菌群16S rDNA測序分析Alpha多樣性分析為基于統(tǒng)一深度下計(jì)算不同樣本的多樣性指數(shù)。結(jié)果顯示,兩組大鼠腸道菌群豐度和多樣性無顯著性差異(P>0.05,圖2A、B);Beta多樣性的主成分分析(principal component analysis,PCA)顯示,對照組和ICP組菌群組成出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05,圖2C、D)。

圖2 Alpha 多樣性和Beta多樣性分析

采用非參數(shù)Wilcoxnt檢驗(yàn)分析兩組大鼠腸道細(xì)菌在門、屬和種水平上的差異。結(jié)果顯示,有8個(gè)門的細(xì)菌出現(xiàn)了顯著變化。ICP組的梭桿菌門(Fusobacteriota)和擬桿菌門(Bacteroidota)細(xì)菌顯著升高;而絲狀桿菌門(Fibrobacterota)、螺旋菌門(Spiro-chaetota)顯著下降(P<0.05,圖3A);在屬水平,組間差異的前10中Clade-Ⅲ、副擬桿菌(Parabacteroides)、真桿菌(Eubacterium)、瘤胃球菌(Ruminococcus)在ICP組顯著降低;而普雷沃菌(Prevotella)、羅氏菌(Roseburia)、嗜木聚糖真桿菌群組(E.xylanophilumgroup)、梭桿菌(Fusobacterium)在ICP組顯著升高(P<0.05,圖3B)。進(jìn)一步在種水平的分析發(fā)現(xiàn),在ICP組中,單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis)、羅爾斯通菌(Ralstoniainsidiosa)、狄氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)、Clostridialesbacterium等顯著降低;而豬腸支原體(Metamycoplasmasualvi)、螺桿菌(Helibacterapodemus)、柯林斯菌(Collinselastercoris)等顯著升高(P<0.05,圖3C)。

圖3 兩組大鼠腸道菌群在門、屬和種水平的差異

2.4 腸道標(biāo)志性菌種、隨機(jī)森林分析和功能預(yù)測指示性菌種分析主要是指篩選大鼠腸道中能對生長環(huán)境產(chǎn)生較大影響的生物種屬或群落。ICP組指示性菌種中,變形菌、普氏菌和羅氏菌占優(yōu)勢;而益生菌狄氏副擬桿菌、單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis)顯著減少(圖4)。隨機(jī)森林分析發(fā)現(xiàn),副擬桿菌、梭桿菌、普拉梭桿菌和志賀氏大腸埃希菌是區(qū)分ICP組和對照組大鼠最重要的前5個(gè)重要腸道菌屬(圖5)。此外,基于16S rDNA測序的KEGG功能預(yù)測發(fā)現(xiàn),ICP組大鼠氨基酸和次級代謝產(chǎn)物的生物合成、碳水化合物代謝、微生物代謝通路顯著降低(圖6)。

圖4 對照組和ICP組大鼠腸道菌群指示性物種差異分析

圖5 Random Forest隨機(jī)森林分析

圖6 KEGG功能預(yù)測分析

3 討論

ICP是孕期較常見的肝臟疾病,對母體和胎兒危害嚴(yán)重。胎糞污染羊水可致新生兒抑郁癥和呼吸窘迫綜合征等。研究[6]報(bào)道,ICP孕婦的早產(chǎn)、死胎和新生兒住院的比例顯著上升。近年發(fā)現(xiàn)ICP患者腸道菌群在宿主代謝和免疫中發(fā)揮重要作用,且可影響妊娠結(jié)局[7]。腸道菌群失調(diào)與膽汁淤積、膽管炎和肝硬化密切相關(guān);患病母體出生的患兒腸道菌群多樣性顯著降低,且與肝臟生化指標(biāo)之間有高度相關(guān)性。臨床也發(fā)現(xiàn)ICP母體初級膽汁酸合成、膽汁分泌、牛磺酸和亞牛磺酸水平升高,腸道菌群出現(xiàn)顯著差異[8]:擬桿菌(Bacteroides)升高,梭菌(Faecalibacterium)、布勞特菌(Blautia)和真桿菌(Eubacte-rium)等產(chǎn)SCFAs的細(xì)菌明顯減少。Zhan et al[9]最近對45例ICP患者研究發(fā)現(xiàn),大腸志賀氏菌(Escherichiashigella),歐陸森菌(Olsenella)和蘇黎世桿菌(Turicibacter)豐度升高;血清TBA、ALT、AST、DBIL和TBIL異常升高。已知母體腸道菌群在維持正常妊娠,子代菌群的定植、營養(yǎng)、免疫系統(tǒng)的構(gòu)建以及抵抗病原體感染等均發(fā)揮了重要作用。但有關(guān)母體ICP對其自身腸道菌群構(gòu)成的影響尚未見報(bào)道。

本研究采用苯甲酸雌二醇+黃體酮構(gòu)建了SD大鼠的ICP模型。大鼠血清肝臟生化指標(biāo)水平異常升高(P<0.05),肝細(xì)胞出現(xiàn)大量脂肪變性、點(diǎn)狀壞死、顯著的炎性細(xì)胞浸潤和部分膽栓形成,表明模型構(gòu)建成功。本研究基于ICP大鼠腸道菌群的16S rDNA測序分析發(fā)現(xiàn),幾種腸道益生菌豐度明顯下降,如副擬桿菌、單形擬桿菌、真桿菌、Clostridialesbacterium和瘤胃球菌。已知狄氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)是正常胃腸道擬桿菌屬的代表性菌種,體內(nèi)活菌移植能顯著升高石膽酸和熊去氧膽酸水平,提升腸道琥珀酸的濃度,減輕高脂飲食小鼠的體質(zhì)量、降低血糖并減輕肝臟脂肪變性,并修復(fù)腸黏膜屏障。因此狄氏副擬桿菌在維持機(jī)體正常代謝中發(fā)揮重要作用[10],還可降低γ-谷氨酸水平,升高下丘腦GABA/谷氨酸比值。有報(bào)道用單形擬桿菌治療肥胖小鼠可改善糖代謝、提升丁酸水平,抑制IL-22介導(dǎo)的肝組織炎癥,治療糖尿病小鼠療效顯著,可抑制小鼠的肥胖[11]。此外,本研究提示真桿菌在ICP組顯著減少。真桿菌是腸道益生菌的核心成員之一,有些菌種可產(chǎn)生丁酸等SCFAs,調(diào)節(jié)代謝、促進(jìn)腸道蠕動(dòng),抑制腸黏膜炎癥、抑制結(jié)腸癌和動(dòng)脈硬化,降低IL-2和C反應(yīng)蛋白等炎性標(biāo)志物。此外,真桿菌還參與腸-肝膽汁酸代謝和膽固醇轉(zhuǎn)化,維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12]。除了擬桿菌外,真桿菌、羅氏菌、普拉梭菌均可分泌膽鹽水解酶。膽鹽水解酶不僅維持菌群代謝,還可調(diào)節(jié)脂質(zhì)吸收和糖代謝,維持能量平衡。

本研究顯示,ICP模型大鼠腸道普雷沃菌(Prevotella)豐度增加。該屬細(xì)菌在人體可引起牙周炎和陰道炎,與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、代謝性疾病和全身感染有關(guān),也可通過TLR2激活Th17應(yīng)答,分泌IL-1、IL-6、IL-23等介導(dǎo)黏膜炎癥[13]。此外梭桿菌(Fusobacterium)也成為ICP組大鼠腸道的指示性菌種。梭桿菌的有些種類為侵襲性厭氧菌,多存在于腸黏膜炎性組織。Castellarin et al[14]研究發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌(F.nucleatum)與結(jié)腸癌及其淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切有關(guān)。ICP母體的腸道菌群失調(diào)不僅有可能加重自身肝臟的損傷,同時(shí)也可能成為影響子代腸道微生態(tài)的重建的重要因素[15]。此外,KEGG分析顯示,兩組大鼠中豐度變化最大的菌群均集中在代謝相關(guān)的通路和遺傳信息處理等。本研究中見到,ICP組大鼠腸道菌群中富集到個(gè)別對人體有益生作用的腸道菌,如雙歧桿菌和乳酸桿菌豐度升高,其原因有待進(jìn)一步觀察。

(致謝:本文承蒙安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室何茂章博士協(xié)助數(shù)據(jù)分析和指導(dǎo),在此深表感謝。)