LncRNA HAGLR激活RUNX2并抑制NLRP3炎癥小體對脛骨骨折愈合的影響

王 文,陳新宇,黃茲藝,鄧楊柳,崔紅旺

骨折愈合是一個復雜且漫長的過程,多種生長因子和細胞炎癥因子參與骨折的愈合過程,負責調節細胞活化和成骨細胞增殖[1-3]。研究[4]發現,NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain-associated protein 3,NRLP3)炎癥小體不僅能激活炎癥反應而且還參與了骨質疏松進展的調控,在延遲骨折愈合的過程中扮演重要角色。然而,其上下游的調控機制并不清楚。長非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類大于200個核苷酸的非編碼轉錄本家族[5],通過調節Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)和炎癥小體密切參與骨折愈合的調控[6-8]。同源框D基因簇反義生長相關的長非編碼RNA(homeobox D gene cluster antisense growth-associated long noncoding RNA,HAGLR)是一種關鍵的LncRNA[9-11]。已知HAGLR在股骨頸骨折中表達降低[12],但對脛骨骨折(tibial fracture,TF)的調控作用仍不清楚。該研究擬建立TF模型,探討HAGLR對骨折的愈合作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 小鼠成骨細胞MC3T3-E1購于武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM培養基購于美國GIBCO公司;胎牛血清購于美國Merck Millipore公司;沉默HAGLR的陰性對照(si-NC)、沉默HAGLR的小干擾RNA載體(si-HAGLR)、pcDNA3.1空載體(pcDNA-null)、pcDNA3.1-HAGLR過表達載體(pcDNA-HAGLR)、短發夾RNA載體陰性對照(sh-NC)、沉默RUNX2的短發夾RNA載體(sh-RUNX2)構建于上海吉瑪制藥技術有限公司;NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950購于美國MCE公司;Lipofectamine 2000購于美國Thermo Fisher Scientific公司;CCK-8試劑盒、TUNEL染色試劑盒、RIPA 裂解緩沖液購于上海碧云天生物技術有限公司;TRIzol試劑購于美國Thermo Fisher Scientific公司;TransScript和cDNA合成試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司;Universal SYBR Green Fast qPCR Mix Kit購于美國ABclonal公司;GAPDH購于美國Cell Signaling Technology公司;HRP標記的親和山羊抗兔鼠IgG(H+L)二抗購于美國Protein Tech Group公司;PVDF購于上海碧云天生物技術有限公司;RUNX2一抗、 p-RUNX2一抗、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)一抗購于美國 Cell Signaling Technology公司;NLRP3、Caspase1、ASC、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的一抗購于北京生工生物工程有限公司。

1.1.2實驗動物 100只成年雄性C57BL/6小鼠,10周齡,體質量(31.25±1.66) g,購于海南藥物研究所有限責任公司(許可證號:SCXK2020-0007)。所有小鼠均在受控溫度(21～23 °C)下喂養,12 h/12 h光/暗周期模擬白天/夜晚變化,并自由獲取食物和水。本研究中使用的所有動物都按照機構動物護理指南接受了人道護理。所有手術和實驗程序均通過海南醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1動物分組與建模 TF小鼠建模方法按文獻[13]提供的方法,用1%戊巴比妥鈉按1 ml/kg腹腔注射麻醉小鼠后,備皮、消毒小鼠右下肢,在小鼠右側膝關節下切開約0.5 cm縱行切口,由臏腱處插入22 G/0.41 mm 髓內固定針,于脛骨中上1/3處分離肌肉及筋膜,使用鋸片鋸斷脛骨骨干后立即使用0.9%生理鹽水沖洗脛骨表面,再將髓內固定針完全插入并對合。逐層縫合切口,制成TF模型小鼠。將20只小鼠按隨機數表法分為健康組(Normal組,正常飼養,n=10)和TF組(n=10)。另,將80只雄性C57BL/6小鼠在TF術后10 d,隨機分為8組進行治療:pcDNA-null+TF組[pcDNA-null以20 μg/(kg· d)靜脈注射];pcDNA-HAGLR+TF組[pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)靜脈注射];sh-NC+TF組[sh-NC以20 μg/(kg· d)靜脈注射];sh-RUNX2+TF組[sh-RUNX2以20 μg/(kg· d)靜脈注射];sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF組[sh-NC以20 μg/(kg· d)靜脈注射,pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)靜脈注射];sh-RUNX2+pcDNA-HAGLR+TF組[sh-RUNX2以20 μg/(kg· d)靜脈注射,pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)靜脈注射];saline+pcDNA-HAGLR+TF組[聯合注射,其中saline以100 μl/(kg· d)靜脈注射,pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)靜脈注射];MCC950+pcDNA-HAGLR+TF組[聯合注射:MCC950以20 mg 100 μl/(kg· d)靜脈注射,pcDNA-HAGLR以20 μg/(kg· d)靜脈注射]。每組10只小鼠,連續注射4 周后分離全長脛骨并稱濕重。隨后將各組小鼠的脛骨組織保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2MC3T3-E1細胞培養 使用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃下,含95%空氣和5% CO2的培養箱中培養MC3T3-E1細胞。細胞每2 d換液一次,取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.3MC3T3-E1細胞轉染si-HAGLR 采用Lipofectamine 2000將10 nmol/L si-NC或si-HAGLR轉染入MC3T3-E1細胞中。24 h后收集細胞用于qPCR檢測。

1.2.4qPCR檢測HAGLR、BALP、骨鈣素和RUNX2的表達 收集si-NC組和si-HAGLR組細胞用于檢測HAGLR、骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)、骨鈣素的表達。收集Normal組、TF組、pcDNA-null+TF組、pcDNA-HAGLR+TF組、sh-NC+TF組、sh-RUNX2+TF組、sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF組、sh-RUNX2+pcDNA-HAGLR+TF組骨組織(用于檢測HAGLR和RUNX2的表達,骨組織研磨后浸入液氮粉化)。使用Trizol法提取待測組織或細胞的總RNA。用DNase I處理1 μg總RNA,進行逆轉錄。并根據制造商的說明,使用SYBR?Green PCR進行qPCR分析。qPCR引物序列見表1。在96孔光學反應板中進行40個循環進行擴增,1個循環中94 °C變性5 s,63 °C退火30 s,72 °C延伸60 s。以GAPDH作內參基因,2-ΔΔCt法計算分析目的基因的表達水平。

表1 qPCR引物序列

1.2.5CCK-8檢測MC3T3-E1細胞的增殖 根據生產商提供的說明,將轉染si-NC或si-HAGLR的MC3T3-E1細胞接種至96孔板中,培養24、48、72、96 h后去除培養液,在避光下向每孔加入100 μl 含10% CCK-8溶液的DMEM完全培養液,37 ℃孵育4 h后終止培養,室溫下置于搖床振蕩5 min。在酶標儀上測定450 nm 處吸光度值。實驗重復3次。

1.2.6TUNEL檢測MC3T3-E1細胞的凋亡 根據生產商提供的說明,于細胞爬片上培養MC3T3-E1細胞并轉染si-NC或si-HAGLR,培養24 h后去除培養液,在避光下向每孔加入50 μl TUNEL試劑盒工作液,并繼續孵育12 h。DAPI核染15 min后加入抗熒光淬滅液封片,熒光顯微鏡上觀察拍照。細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞/總細胞×100%。

1.2.7Western blot檢測RUNX2和NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達 收集各組細胞和各組小鼠股骨組織,將組織勻漿后,在冰上于RIPA 裂解緩沖液中裂解細胞和組織。BCA法測定細胞與組織中的蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品,SDS-PAGE凝膠進行分離。隨后,轉移蛋白到PVDF上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉后,加入RUNX2和p-RUNX2、NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1β、IGF-1一抗,并在在4 ℃下孵育過夜。次日,加入HRP標記二抗在室溫下孵育2 h。隨后用增強的化學發光試劑顯色,并使用Image J軟件進行分析。

1.2.8微計算機斷層掃描(micro-computed tomography,micro-CT)測量小鼠骨痂骨體積(mouse bone volume,MBV) 近端干骺端區域內的骨形態測量使用micro-CT對脛骨進行量化。在背腹方向掃描250個切片(厚度13 μm)。使用三角測量算法進行骨骼的三維重建。測量小鼠骨痂骨尺寸,并生成MBV值。

2 結果

2.1 TF小鼠骨折組織中HAGLR的表達圖1A為TF后不同周的TF小鼠的X光片。在第1周和第2周無骨愈合特征,第4周出現了骨愈合組織和骨折形態,這表明TF模型小鼠造模成功。qPCR法檢測結果顯示:與Normal組比較,HAGLR在TF組小鼠骨組織中表達下調[(7.05±1.21)vs(2.61±0.49),t=8.662,P=0.031],差異有統計學意義,見圖1B。

圖1 TF模型觀察及骨折組織中HAGLR的表達

2.2 敲低HAGLR誘導小鼠成骨細胞的凋亡和NLRP3炎癥小體的表達qPCR結果顯示:與si-NC組比較,si-HAGLR組MC3T3-E1細胞中HAGLR表達顯著降低[(1.00±0.12)vs(0.46±0.03),t=13.216,P=0.002,圖2A]。CCK-8實驗結果顯示:與si-NC組比較,si-HAGLR組MC3T3-E1細胞的增殖活力明顯降低(F=9.662,P=0.014,圖2B)。TUNEL染色結果顯示:與si-NC組比較,si-HAGLR組MC3T3-E1細胞的凋亡率顯著升高[(4.12±0.43)%vs(8.51±0.92)%,t=11.602,P=0.003,圖2C)]。隨后,通過qPCR檢測BALP mRNA和骨鈣素mRNA的表達水平來評估HAGLR對成骨細胞活性的調節作用,結果顯示:與si-NC組比較,si-HAGLR組MC3T3-E1細胞BALP和骨鈣素的mRNA水平均明顯下調(BALP:t=15.236,P=0.002;骨鈣素:t=13.251,P=0.003,圖2D、E)。Western blot檢測NLRP3炎癥小體相關蛋白NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1β表達,結果顯示:與si-NC組比較,si-HAGLR組MC3T3-E1細胞中NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1β蛋白表達均明顯升高(NLRP3:t=9.503,P=0.035;Caspase1:t=15.446,P=0.003;ASC:t=10.305,P=0.007;IL-1β:t=8.528,P=0.022,圖2F～J)。

圖2 敲低HAGLR誘導小鼠成骨細胞的凋亡和NLRP3炎癥小體表達的影響

2.3 HAGLR調控RUNX2的表達在MC3T3-E1細胞中,與si-NC比較,si-HAGLR組中RUNX2的mRNA和蛋白水平均顯著降低(t=17.089、12.887,P=0.001、0.019,圖3A、B),且p-RUNX2蛋白水平也降低(t=12.007,P=0.008,圖3C)。在小鼠骨組織中,與Normal組比較,RUNX2的mRNA在TF組織中的表達水平明顯降低(t=7.669,P=0.025,圖3D)。在小鼠體內沉默RUNX2或者過表達HAGLR,qPCR結果顯示:與pcDNA-null組比較,pcDNA-HAGLR組的HAGLR和RUNX2 mRNA表達水平均明顯升高(HAGLR:t=12.606,P=0.003;RUNX2:t=14.662,P=0.002)。但與sh-NC組比較,sh-RUNX2組的HAGLR水平變化差異無統計學意義(t=2.544,P=0.179),RUNX2 mRNA表達明顯降低(t=10.570,P=0.016),見圖3E、F。

圖3 HAGLR對RUNX2表達的影響

2.4 沉默RUNX2逆轉HAGLR對小鼠骨組織愈合的促進作用各組TF造模4周后骨組織愈合指標的比較結果顯示:與Normal組比較,TF組、pcDNA-null+TF組、pcDNA-HAGLR+TF組、sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF組和sh-RUNX2+pcDNA-HAGLR+TF組的MBV(F=116.332,P=0.002)、全長脛骨濕重(F=103.899,P=0.006)、IGF-1蛋白表達水平(F=96.177,P=0.018)均明顯升高。與TF組比較,pcDNA-null+TF組的上述指標變化差異無統計學意義(P>0.05)。與pcDNA-null+TF組比較,pcDNA-HAGLR+TF組和sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF組的MBV、全長脛骨濕重、IGF-1蛋白表達水平均明顯增加(P<0.05)。而與sh-NC+pcDNA-HAGLR+TF組比較,sh-RUNX2+pcDNA-HAGLR+TF組MBV、全長脛骨濕重、IGF-1蛋白表達均降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 沉默RUNX2逆轉HAGLR對小鼠骨組織愈合的促進作用

2.5 抑制NLRP3炎癥小體促進HAGLR對小鼠骨組織的愈合作用用NLRP3炎癥小體選擇性抑制劑MCC950抑制NLRP3炎癥小體的表達后比較各組小鼠骨組織愈合指標。結果顯示:與Normal組比較,TF組、pcDNA-null+TF組、pcDNA-HAGLR+TF組、saline+pcDNA-HAGLR+TF組和MCC950+pcDNA-HAGLR+TF組的MBV(F=254.889,P=0.001)、全長脛骨濕重(F=90.065,P=0.022)、IGF-1的蛋白表達水平(F=108.254,P=0.005)差異均有統計學意義;與pcDNA-null+TF組比較,pcDNA-HAGLR+TF組和saline+pcDNA-HAGLR+TF組的MBV、全長脛骨濕重、IGF-1的蛋白表達水平差異均有統計學意義(P<0.05);與saline+pcDNA-HAGLR+TF組比較,MCC950+pcDNA-HAGLR+TF組MBV、全長脛骨的濕重、IGF-1的蛋白相對表達量均明顯增加(P<0.05)。見圖5。

圖5 抑制炎性小體促進HAGLR對小鼠骨組織愈合的促進作用

3 討論

本實驗在體內外水平探究了HAGLR調控TF愈合的潛力,結果表明HAGLR在TF小鼠骨組織中表達降低,沉默HAGLR后小鼠成骨細胞中成骨標志物和RUNX2的表達均降低,但細胞凋亡率和NLRP3炎癥小體表達水平增加。在TF小鼠中過表達HAGLR后不僅可促進RUNX2的表達增加,還明顯改善了MBV、全長脛骨濕重和IGF-1的蛋白表達量。沉默RUNX2則可明顯抑制過表達HAGLR對TF小鼠MBV、全長脛骨濕重、IGF-1表達的上調功能,而抑制NLRP3炎癥小體則進一步促進了TF小鼠MBV、全長脛骨濕重、IGF-1的表達,提示HAGLR在TF骨折愈合中扮演重要角色。

既往研究[11]報道稱HAGLR在股骨骨折組織中下調,且可通過調控細胞增殖和凋亡參與調控骨折的愈合。本研究結果同樣表明,HAGLR在TF組織中的表達降低,且過表達HAGLR可以明顯促進骨痂生長,而沉默HAGLR可以明顯抑制前成骨細胞的增殖并促進凋亡,提示過表達HAGLR可能具有促進骨折愈合的功能。

影響骨折愈合的主要因素為骨折端的血供不良,導致骨營養缺乏。RUNX2是促進骨折愈合的關鍵標志物,其可通過激活骨形態發生蛋白2通過Smad信號通路誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化,從而促進骨折愈合[14]。已有研究發現LncRNA KCNQ1OT1可上調RUNX2和骨鈣素[15],而且lncRNA MEG3也具有類似效果[16],表明LncRNA可作為一種潛在的成骨細胞分化的重要分子。有研究[17]報道RUNX2表達與骨形成密切相關,并且RUNX2的表達水平升高代表骨折愈合增加。本研究結果觀察到TF骨組織中RUNX2表達降低,而過表達HAGLR則可以恢復RUNX2和p-RUNX2的表達,但沉默HAGLR則可以抑制成骨細胞中的RUNX2和p-RUNX2,表明HAGLR會促進骨折愈合,與RUNX2的調控密切相關。研究[17]發現,骨骼生長刺激因子IGF-1的缺乏對骨骼結構發育具有負面影響,如在快速生長和骨骼成熟的青春期,循環系統中IGF-1的含量明顯增加,而敲除IGF-1表達則能抑制骨骼的生長。本研究在體內觀察到TF小鼠過表達HAGLR不僅導致MBV和全長脛骨重量的明顯增加,且過表達HAGLR也可導致IGF-1的表達量明顯增加;而在過表達HAGLR基礎上沉默RUNX2則可以明顯抑制過表達HAGLR對TF小鼠MBV、全長脛骨濕重、IGF-1表達的上調功能,提示過表達HAGLR可能通過激活RUNX2促進TF的愈合。

研究[18]表明,特異性抑制NLRP3炎癥小體可明顯增加糖尿病誘導的骨折模型中的MBV、骨體積分數并抑制骨折組織中IFN-γ、TNF-α 和IL-6的表達,抑制小鼠NLRP3炎癥小體還可以促進牙槽骨缺損的愈合,表明NLRP3炎癥小體的抑制藥可能是骨折愈合的潛在治療藥物。本研究發現沉默HAGLR后小鼠成骨細胞的凋亡率和NLRP3炎癥小體均明顯增加,在過表達HAGLR的基礎上使用NLRP3炎癥小體選擇性抑制劑MCC950抑制NLRP3炎癥小體的激活后TF小鼠的MBV、全長脛骨的濕重和IGF-1的蛋白相對表達量都明顯增加,表明過表達HAGLR可通過抑制NLRP3炎癥小體促進TF的愈合。

綜上所述,HAGLR在TF中的表達明顯降低,且其可通過促進RUNX2表達和抑制NLRP3炎癥小體促進骨折愈合。本研究仍然存在一些局限性,如缺乏對小鼠骨折愈合過程中HAGLR分子機制深入探討,下一步課題組將進一步開展研究探討。